基因治疗PPT课件
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❖ 确诊致病基因 ❖ 基因治疗载体构建：替代、沉默、编辑？ ❖ 合适的基因转移载体
8
二、基因治疗载体
❖ 病毒载体：高效性 （最常用） 反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒等
❖ 非病毒载体 脂质体、直接注射或微粒轰击、受体介导内吞等
没有一个基因转移体系是完美的，每一种都有它的优点和局限性
9
反转录病毒（RV）
❖ 优点：能高效感染分裂期和非分裂期细胞；35kb；非整合减 少插入突变
❖ 缺点：表达时间短（2-4w），用于基因高水平的瞬时表达； 有免疫原性
12
13
腺病毒相关病毒（AAV）
❖ 非致病性单链DNA病毒，依赖于腺病毒或疱疹辅助病毒共同 感染后才能复制；未修饰的AAV在19q的特定位点整合至染 色体DNA，提供长效表达但无插入诱变风险
24
患者体内取出的缺陷 T淋巴细胞
改造后的正常T细胞
人体
反转录病毒改造的 ADA基因
25
❖ 4个月内重复治疗4次，患者抵抗力大大增强。 ❖ 尽管该疗法是否真正意义上获得成功还有争议，但是该临床
试验是基因治疗历史上重要的里程碑。这是人类历史上第一 个基因治疗案例。从这一年起，全世界掀起了基因治疗研究 的热潮。
❖ 优点：感染分裂期和非分裂期细胞；免疫反应小 ❖ 缺点：4.5kb ❖ 单基因遗传病基因治疗领域广泛应用
14
❖ ITR为末端重复序列，也是病毒复制和包装唯一需要的顺式作用元件。在
载体中，两个转录单位被治疗基因替代
15
慢病毒（LV）
❖ 应用于非分裂细胞的反转录病毒，随机整合入宿主染色体， 可供基因长效表达。人类免疫缺陷病毒（HIV）是大多数慢 病毒载体的基础
❖ 基因治疗属新兴的治疗技术，技术更迭速度很快 ❖ 目前所有的基因治疗均为体细胞治疗，生殖细胞基因治疗会产
生永久的可传递的修饰，由于伦理原因而被禁止
5
基因治疗方式
❖ 基因添加或替代：提供缺陷基因的一个有功能的拷贝 ❖ 基因沉默：沉默功能获得性突变 ❖ 基因编辑：特定靶点的定向修饰
6
7
基因治疗三因素
26
首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 含有反转录酶的RNA病毒，能够合成其基因组的一个cDNA 拷贝。反转录病毒释放核蛋白复合体至受感染细胞的细胞质 中 ， 此 复 合体 反 转 录 病毒 RNA 基因组 ， 并 随 后将 产 生 的 cDNA整合到宿主细胞一条染色体的单一随机位点。
❖ 优点：能高效感染宿主细胞；整合入染色体随细胞分裂传代 ❖ 缺点：随机整合导致成瘤风险；转染分裂期细胞；8kb
21
基因枪注射
❖ DNA由金属颗粒包装后由特殊的枪发射到细胞中 ❖ 优点：简单、安全 ❖ 缺点：转染效率低
22
三、基因治疗的发展历程
❖ 1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋的结构模型，是分子 生物学划时代意义的伟大事件，从此生命科学的研究进入到了分 子水平。
❖ 1960，Nirenberg和Khoran等人相继破解了遗传密码，揭示了 从DNA到蛋白质的阅读方式为三个碱基组成的三联体对应一种氨 基酸，为我们打开了解人类基因奥秘的大门。
10
❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
11
腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
23
第一次基因治疗人体实验
❖ 1990年9月14日，NIH的Blease教授和Culver教授等人，为一 位4岁女性腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症患者进行人类历史上 的首次基因治疗。
❖ ADA缺陷为常染色体隐性遗传，ADA缺乏可使T淋巴细胞因 代谢产物的累积而死亡，从而导致严重的联合性免疫缺陷症 （SCID）。通常婴儿出生几个月后死亡。
❖ 优点：多种非分裂细胞进行高效的转染和长期稳定表达 ❖ 缺点：随机整合成瘤风险 ❖ 慢病毒载体逐渐成为基因治疗领域的百度文库生力量
16
❖ 首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。更换新鲜 的培养基后，继续培养48～72小时。收集培养液，进行离心浓缩后，就 可得到转导细胞级别的病毒颗粒。
17
脂质体
❖ 脂质体是当某一脂类混于水溶液时自发形成的人造囊泡。 DNA在体外由脂质体包装并被转移，直接用于转移至靶细胞
❖ 优点：容易制备，对转移DNA大小无限制 ❖ 缺点：转移效率低；导入DNA不整合入染色体，瞬时转染
18
❖ DNA被转运到带负电荷的脂质体的内部或结合到带正电荷的脂质体的表面 ❖ 当脂质体与细胞质膜融合时DNA转移就发生了 ❖ 阳离子脂质体是最常用的
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
1
目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
2 2
一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
3
❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
4
基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
19
20
裸基因直接注射
❖ DNA可以用注射器或针头直接注射到靶组织 ❖ 缺点：转染效率低 ❖ 1991年 裸基因注射治疗DMD动物实验，注射的DNA可持续表
达几个月 ❖ 可应用于疫苗，把致病微生物的蛋白质基因整合于质粒载体
中，注射机体后会产生蛋白质作为免疫原，诱导机体免疫反 应以治疗感染性疾病。
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二、基因治疗载体
❖ 病毒载体：高效性 （最常用） 反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒等
❖ 非病毒载体 脂质体、直接注射或微粒轰击、受体介导内吞等
没有一个基因转移体系是完美的，每一种都有它的优点和局限性
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反转录病毒（RV）
❖ 优点：能高效感染分裂期和非分裂期细胞；35kb；非整合减 少插入突变
❖ 缺点：表达时间短（2-4w），用于基因高水平的瞬时表达； 有免疫原性
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腺病毒相关病毒（AAV）
❖ 非致病性单链DNA病毒，依赖于腺病毒或疱疹辅助病毒共同 感染后才能复制；未修饰的AAV在19q的特定位点整合至染 色体DNA，提供长效表达但无插入诱变风险
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患者体内取出的缺陷 T淋巴细胞
改造后的正常T细胞
人体
反转录病毒改造的 ADA基因
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❖ 4个月内重复治疗4次，患者抵抗力大大增强。 ❖ 尽管该疗法是否真正意义上获得成功还有争议，但是该临床
试验是基因治疗历史上重要的里程碑。这是人类历史上第一 个基因治疗案例。从这一年起，全世界掀起了基因治疗研究 的热潮。
❖ 优点：感染分裂期和非分裂期细胞；免疫反应小 ❖ 缺点：4.5kb ❖ 单基因遗传病基因治疗领域广泛应用
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❖ ITR为末端重复序列，也是病毒复制和包装唯一需要的顺式作用元件。在
载体中，两个转录单位被治疗基因替代
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慢病毒（LV）
❖ 应用于非分裂细胞的反转录病毒，随机整合入宿主染色体， 可供基因长效表达。人类免疫缺陷病毒（HIV）是大多数慢 病毒载体的基础
❖ 基因治疗属新兴的治疗技术，技术更迭速度很快 ❖ 目前所有的基因治疗均为体细胞治疗，生殖细胞基因治疗会产
生永久的可传递的修饰，由于伦理原因而被禁止
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基因治疗方式
❖ 基因添加或替代：提供缺陷基因的一个有功能的拷贝 ❖ 基因沉默：沉默功能获得性突变 ❖ 基因编辑：特定靶点的定向修饰
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基因治疗三因素
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首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 含有反转录酶的RNA病毒，能够合成其基因组的一个cDNA 拷贝。反转录病毒释放核蛋白复合体至受感染细胞的细胞质 中 ， 此 复 合体 反 转 录 病毒 RNA 基因组 ， 并 随 后将 产 生 的 cDNA整合到宿主细胞一条染色体的单一随机位点。
❖ 优点：能高效感染宿主细胞；整合入染色体随细胞分裂传代 ❖ 缺点：随机整合导致成瘤风险；转染分裂期细胞；8kb
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基因枪注射
❖ DNA由金属颗粒包装后由特殊的枪发射到细胞中 ❖ 优点：简单、安全 ❖ 缺点：转染效率低
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三、基因治疗的发展历程
❖ 1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋的结构模型，是分子 生物学划时代意义的伟大事件，从此生命科学的研究进入到了分 子水平。
❖ 1960，Nirenberg和Khoran等人相继破解了遗传密码，揭示了 从DNA到蛋白质的阅读方式为三个碱基组成的三联体对应一种氨 基酸，为我们打开了解人类基因奥秘的大门。
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❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
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腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
23
第一次基因治疗人体实验
❖ 1990年9月14日，NIH的Blease教授和Culver教授等人，为一 位4岁女性腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症患者进行人类历史上 的首次基因治疗。
❖ ADA缺陷为常染色体隐性遗传，ADA缺乏可使T淋巴细胞因 代谢产物的累积而死亡，从而导致严重的联合性免疫缺陷症 （SCID）。通常婴儿出生几个月后死亡。
❖ 优点：多种非分裂细胞进行高效的转染和长期稳定表达 ❖ 缺点：随机整合成瘤风险 ❖ 慢病毒载体逐渐成为基因治疗领域的百度文库生力量
16
❖ 首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。更换新鲜 的培养基后，继续培养48～72小时。收集培养液，进行离心浓缩后，就 可得到转导细胞级别的病毒颗粒。
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脂质体
❖ 脂质体是当某一脂类混于水溶液时自发形成的人造囊泡。 DNA在体外由脂质体包装并被转移，直接用于转移至靶细胞
❖ 优点：容易制备，对转移DNA大小无限制 ❖ 缺点：转移效率低；导入DNA不整合入染色体，瞬时转染
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❖ DNA被转运到带负电荷的脂质体的内部或结合到带正电荷的脂质体的表面 ❖ 当脂质体与细胞质膜融合时DNA转移就发生了 ❖ 阳离子脂质体是最常用的
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
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目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
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一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
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❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
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基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
19
20
裸基因直接注射
❖ DNA可以用注射器或针头直接注射到靶组织 ❖ 缺点：转染效率低 ❖ 1991年 裸基因注射治疗DMD动物实验，注射的DNA可持续表
达几个月 ❖ 可应用于疫苗，把致病微生物的蛋白质基因整合于质粒载体
中，注射机体后会产生蛋白质作为免疫原，诱导机体免疫反 应以治疗感染性疾病。