植物花粉和花药培养

四、花粉植株形态发生方式
1、胚状体发育途径
小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。
2、愈伤组织发育途径
小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会 出现变异且倍性复杂。
胚状体发育途径
烟草花药培养
部分花药通过胚状体途径形成小植株
烟草花药培养
通过胚状体途径再生形成小植株
小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相
近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株， 或者核融合形成多倍体植株
三、雄核发育启动机理
1、雄核发育与P花粉的形成
P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染 色花粉（NS-花粉）
2、雄核发育与饥饿处理
饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。

4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合 物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子
梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致）
30%蔗糖梯度离心后 （获得均一的小孢子群体）
(二)花粉培养方式

1、平板培养 2、液体培养 3、双层培养
体培养基。
花粉置琼脂固化培养基上培养。 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 花粉置固体-液体双层培养基上培养。

随着细胞体积迅速增大，细胞核由中央位置推 向一边，即单核靠边期。
营养细胞 生殖细胞 精子
雄配子体的发育
处于不同发育时期的烟草小孢子
四分体: 醋酸洋红染色
单核期
双核期
四分体: Alexander’s 染色
成熟花粉粒
液泡
单核晚期
第一次有丝分裂后期
生殖核 营养核
生殖核
双核早期 双核中期

凹穴载玻片
1滴含单细胞培养液
周围加石蜡油
旁边各加石蜡油
盖盖玻片 置培养皿中26~28 ℃恒 温培养
盖盖玻片
平视图
第一节 花药和花粉培养技术
花粉培养过程
消毒
预培养数天
取花药
取花蕾（镜检） 培养
接种
分离花粉
愈伤组织发生
三、白化苗现象
（一）白化苗产生的影响因素及机理
1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、 花粉发育时期。 2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养 条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生 白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。
AB
AB aB Ab ab AABB aABB AabB aAbB
aB
AaBB aaBB AabB aabB
Ab
ab
AaBb aaBb Aabb aabb
AABb aABb AAbb aAbb
例子：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基 因为AAbb的纯合单株
单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。
一般而言，单核期（第一次 有丝分裂前）对诱导反应最 敏感，为最佳培养期。
形成双核后，在合适的条件 ，主要由营养细胞分裂产生 胚状体。
不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期
发育时期 物种
减数分裂期
四分孢子期 单核早中期 单核晚期 单核早期至晚期 单核早期至双核期 四分孢子期至双核 期
草莓、番茄
葡萄 石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 荔枝、茄子、青椒、小麦 烟草 梨、水稻、甘蓝 玉米

第5章 花药和花粉培养
一、概念
花粉和花药的培养(pollen and anther culture) 是指在人工合成培养基上，改变花粉的发育途径, 使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂\分化， 由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。 单倍体植物(haplobiont) 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的 植株。花药培养、花粉培养；胚珠或子房培养（未受精）
二、花粉培养
(一)花粉的分离与纯化

1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)
将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉 自动散落后，收集培养。

2、挤压法
在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。
3、机械游离
1）磁搅拌法
用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；
2）超速旋切法
通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使 小孢子游离出来（此法应用最广）。
二、雄核发育途径
1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂，形成营养 由营养细胞重复分裂形成单倍体 由生殖细胞重复分裂形成单倍体
细胞和生殖细胞
（1）A-V途径 （2）A-G途径
（3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独 立分裂，共同形成单倍体 （4）C途径 体植株 2、B途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍
第5章 花药和花粉培养
异同点：
相同点：二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细 胞，最后发育成单倍体植株。 不同点： 花药培养属器官培养，花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药 壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒 花粉培养属细胞培养: 花粉培养没有药壁组织干扰； 可计数小孢子产胚率； 可观察雄核发育的全过程； 单倍体产量高。 但技术更复杂，比花药培养难度大。
植物组织培养
第五章 花药和花粉培养
大 家 好 ！
第5章 花药和花粉培养
第五章 花药和花粉培养
本章主要内容：
花粉和花药培养的概念和应用 花粉小孢子发育途径
花粉和花药培养方法
单倍体植株鉴定和染色体加倍
第一节 花粉和花药培养的概念和应用
花粉和花药培养的概念 花药和花粉培养的历史 花粉和花药培养的应用
一、花药培养


1、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的 花蕾。 2、消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡3060s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯 化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。 3、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养， 至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形 成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植 株。
10-100
0.01-1
0.001-0.01
（二）供体植株生长条件和生理状态
1、植株生长条件 2、植株生长时期 3、P花粉的频率 光温等因素均能影响花药培养力。一般 一般是开花始期优于开花末期。 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物
处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。
质处理提高P花粉的数量
克服后代分离，大大缩短育种周期
2) 提高目标基因型的选择效率
花粉单倍体是纯合配子体，从来源于配子体的 植株中选择某一种基因型的概率是(1/2)n，而 从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的 概率为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常 规育种的2n倍。
例子：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb 的纯合单株 常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、 aAbb区分开。
5、用于遗传转化

能直接表达外源基因，不受显隐性影响
ห้องสมุดไป่ตู้二节 花粉孢子体发育途径

概念：花粉孢子体发育途径（雄核发育途径）
花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝 分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把 花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径，也叫 雄核发育途径
一、花粉发育的阶段
花粉离体培养时，雄核发 育最适宜的时期一般是第 一次有分裂或之前。
单倍体 二倍体 AB------ --------------------> AABB aB----------------------------> aaBB Ab----------------------------> AAbb ab-- --------------------------> aabb
（二）白化苗的控制

通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行 调控。
四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素

（一）基因型
植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。 同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异 较大。 如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。
（三）花粉发育时期
小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。
培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液
4、看护培养

利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢 子发育。用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织
2.
1）在一个培养瓶中加入一定 量厚的固体培养基，灭菌 后备用。 2）在无菌条件下，将一小块 （1cm3）活跃生长的愈伤 组织接种到培养基上，再 在愈伤组织块上放一片 （1cm² ）已灭菌的滤纸， 放置过夜。 3）将分离的花粉接种到已经 充分吸收愈伤组织渗透液 的滤纸上。
供体亲本 AaBb
花培
从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是 (1/2)n，而从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的概率 为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍。
3)诱变育种中的作用

植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获
得突变个体，染色体加倍后成为稳定的纯系。
适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期 (单核靠边期)
芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产 胚率比较
基因型
Topas Westar
胚状体数量/106小孢子
10,000-200,000 1000-10,000
成苗率（%）
1-20 0.1-1
Delta
Bounty
100-10,000
胚状体发育途径
a) 球形胚
d) 鱼雷形胚
芸苔属小孢子培养
愈伤组织发育途径
接种在平板上的水稻花药
部分花药产生愈伤组织
水稻花药培养
水稻花药培养
愈伤组织转接种到再生培养基
愈伤组织分化形成再生植株
第三节 花粉和花药培养方法

一、花药培养 二、花粉培养 三、白化苗现象 四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素
1、作物育种
1)诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；
供体植株 小孢子（n） 花培 雄核发育 花粉植 株（n） 自然加倍 人工加倍 纯合植株DH （2n）
一年内获得纯系 常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。
第二节 花药和花粉培养的应用
常规育种在杂交F5、F6代开始选择；花药 培养在F1或F2代进行培养，再人工加倍处 理．缩短育种周期3--5年
2、物种进化研究
可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植 物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确 定染色体组内是否存在同源染色体。
3、遗传分析
单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个
基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质
及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。
4、构建连锁图谱
双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效 地用于遗传图谱的构建。
4）单细胞分裂形成肉眼可见 的小细胞团后，即转移到 新鲜培养基上培养，恒温 培养，得到单细胞无性系。
看护培养图解

5、微室培养
利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。

6、条件培养基培养
利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的 培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。
微室培养图示：

80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子
培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续

成功Konzak (1999) 。
通过 花药 培养 育成 的甜 椒新 品种 ： 海花 三号
第5章 花药和花粉培养
三、花药和花粉培养的应用
花粉发育时期的确定

对不同发育阶段的花药 进行培养测试 确定最佳小孢子发育时 期的形态特征 注意形态特征会因品种、 发育状态、环境条件的 变化而发生变化

处于不同发育阶段的烟草花芽

单核期的确定：


根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始 积累淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用 醋酸洋红或碘化钾染色，再压片镜检，以确定 花粉的发育时期。 但是接种前不可能把所有的花粉都进行一 次发育时期的镜检，通常是按照花蕾长度大小 与花粉发育年龄的相关性，实际操作中取一定 大小的花蕾进行的。

二、植物花药/花粉培养历史

Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养 Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养）
Chu（1973）小麦花粉培养
（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自 发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）