细菌染色体DNA的提纯与纯化
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细菌染色体DNA的提纯、纯化与电泳检测
摘要
本实验用试剂盒 Bacterial DNA isolation kit(Omega) 提取黄色粘球菌DK1622的染色体DNA, 并且通过一系列的分离纯化技术将其染色体DNA与RNA、蛋白质、脂类、碳水化合物等杂质分开从而得到纯化的染色体DNA分子。
通过琼脂糖凝胶电泳的方法可以分析所提取染色DNA的量的多少,纯化结果如何,以及杂带产生的原因,从而在今后的实验中完善实验方法,严谨实验步骤。
关键词
黄色粘球菌试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)琼脂糖凝胶电泳
引言
黄色粘球菌DK1622是一种特殊的细菌,它不含质粒DNA,只含染色体DNA,所以用试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)提取的是他的染色体DNA。
此外,它还有其他特性:基因组全长9.13Mb,代时4小时,胞外基质富含粘多糖等。
生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。
真核细胞的DNA 主要存在于细胞核中,与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。
而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合,因此,黄色粘球菌DK1622的染色体DNA是裸露的,不与任何组蛋白结合。
染色体DNA的提取一般包括:①破碎细胞;②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子;③沉淀核酸;④去除盐类、有机溶剂等杂质;⑤纯化干燥;⑥溶解等几个主要步骤。
破碎细胞是为了释放DNA,其方法因样本不同而不同,可用反复冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。
蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程,因此,在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。
一般去除蛋白质常用酚/氯仿抽提法。
酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用,而对DNA无影响,经酚/氯仿抽提后,蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面,DNA则留在水相。
这种方法对于去除DNA中大量的蛋白质杂质是行之有效的,因此也是DNA纯化中的基本方法。
少量的或与DNA紧密结合的蛋白质杂质则可用蛋白酶予以去除。
DNA制品中也会有RNA 杂质,但RNA极易降解。
况且,少量的RNA对DNA操作无大影响,必要时可加入不含DNase的RNase以去除RNA的污染。
为了除去分离过程中残留的有机溶剂,常用的方法是利用冷乙醇和盐沉淀核酸,通过离心将核酸回收。
用70%~80%乙醇洗涤沉淀,可除去沉淀中多余的盐,以避免其对核酸溶解的影响以及对后续步骤的酶促反应的抑制作用。
由于染色体DNA一般都很长,对剪切力十分敏感,提取时容易发生机械断裂,产生大小不同的片段。
因此,在染色体DNA提取过程中,为保证得到较长的DNA,应尽量避免以下因素导致的DNA降解:
(1)物理降解。
在实际操作时应尽可能轻缓,尽量避免过多的溶液转移和剧烈的振荡等,以减少机械张力对DNA的损伤,同时也应避免过高的温度。
此外,操作所用的吸头口不能太小,应剪去尖端部分,使其孔径变大。
(2)细胞内源DNase的作用。
细胞内常存在活性很高的DNase,细胞破碎后,DNase便可与DNA接触并使之降解。
为了避免DNase的作用,在溶液中常加入EDTA、SDS以及蛋白酶等。
EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用,而Ca2+和Mg2+是DNase的辅助因子。
SDS和蛋白酶则分别具有使蛋白质变性和降解的作用。
(3)化学因素也会降解DNA。
例如,过酸的条件下,由于DNA存在腺嘌呤而导致DNA的不稳定,极易在碱基脱落的地方发生断裂。
因此,在DNA提取过程中,应避免采用过酸条件。
不同生物(植物、动物、微生物)的染色体DNA的提取方法有所不同。
目前,也有许多商品化的核酸分离柱,可简单、快速地分离到高纯度的DNA。
本实验用试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega) 提取黄色粘球菌DK1622的染色体DNA。
电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。
各种生物大分子在一定pH条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。
凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。
凝胶是电泳支持介质,具有分子筛效应。
含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。
利用移动速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。
因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。
正文
1.材料和方法
1.1 材料和试剂
实验材料:黄色粘球菌DK1622
实验试剂:试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega):TE溶液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA (pH 8.0))、BTL buffer、proteinase K、RNase A、BDL buffer、buffer HB、wash buffer、无水乙醇、Elution Buffer、琼脂糖、灭菌双蒸水ddH2O、50×TAE缓冲液、10mg/mL溴化乙锭(EB)溶液、6×上样缓冲液(6×loading buffer)。
1.2实验方法
1.黄色粘球菌DK1622的培养与增值
将32℃,200rpm的震荡培养的黄色粘球菌DK1622产物的1%接种于新的LB液体培养基中,在32℃,200rpm的震荡培养20小时。
2.实验前准备
打开水浴锅的三个开关,将温度分别调整到37℃、65℃和55℃。
3. 黄色粘球菌DK1622菌体的收集
(1)将黄色粘球菌培养液倒入1.5mL Ep管中,10,000rpm离心2min,弃上清;(2)继续倒入黄色粘球菌培养液于上1.5mL Ep管中,10,000rpm离心2min,使1.5mL Ep管中共收集3.0mL培养液中的菌体;
(3)向菌体沉淀中加入500μL TE,充分涡旋重悬;
(4)将菌液在离心机中10,000rpm离心2min,尽可能吸弃上清;
4.黄色粘球菌DK1622菌体的裂解
(1)向菌体沉淀中加入200μL BTL buffer,涡旋重悬;
(2)向菌液中加入25μL proteinase K溶液,涡旋混匀;
(3)将菌液55℃水浴45min,期间每15~20min振荡混匀一次;
(4)向菌液中加入5μL RNase A,颠倒混匀;
(5)将菌液放置在水浴锅中37℃水浴30min。
(6)将菌液在12,000rpm离心5min,沉淀不溶性细胞碎片;
(7)小心转移上清到一新的Ep管中;
(8)加入220μL BDL buffer,颠倒混匀;
(9)65℃水浴10min;
(10)加入220μL 无水乙醇,充分涡旋,确保没有任何沉淀;
(11)将DNA纯化柱(蓝色)组装到2mL收集管上;
(12)将上述样品全部、小心转移到柱子中;
(13)12,000rpm离心1min,弃流出液;
(14)将柱子组装到第二个收集管上,加入500μL buffer HB;
(15)12,000rpm离心1min,弃流出液;
(16)将柱子组装到同一个收集管上,加入700μL wash buffer;
(17)12,000rpm离心1min,弃流出液;
(18)再加入700μL wash buffer,12,000rpm离心1min,弃流出液;
(19)使用同一收集管,13,000rpm离心2min,除去残留的乙醇;
(20)将柱子安装到新的Ep管上,加入50μL 65℃预热的Elution Buffer,室温静置5min;
(21)将Ep管12,000rpm离心1min,收集DNA;
(22)再将Ep管12,000rpm离心1min,重复收集一次DNA。
5.0.8% 琼脂糖凝胶的制备
(1)配制2L 1×TAE:取40mL 50×TAE,用双蒸水将其稀释至2L;
(2)正确组装制胶槽、制胶板、样品梳;
(3)取40mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中,称量0.3g琼脂糖,混匀,轻旋瓶盖,微波炉加热沸腾3-4次,至溶液澄清无颗粒;
(4)待溶液冷却至60℃左右,加入20μL 1mg/mL的溴化乙锭(EB)溶液,使EB溶液终浓度为0.5mg/mL,混匀后倒入制胶槽中,冷却凝固待用(冷却凝固时间要在30min以上)。
6.电泳上样
(1)取1.0μL纯化DNA、4μL双蒸水、1μL上样缓冲液(6×loading buffer),用微量移液器吹吸混匀;
(2)将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中,添加1×TAE至高出胶面约1mm;
(3)将上述混合好的DNA样品,按照表顺序,点样到凝胶中。
7.凝胶电泳与DNA分离
(1)开启电泳仪电源,选择合适的电压120V和时间40min;
(3)将电泳槽电极与电泳仪连接。
电泳槽红色电极为正极,与电泳仪正极相连。
电泳槽黑色电极为负极,与电泳仪负极相连;
(4)启动电泳,待观察到负极有气泡升起方可离开;
(5)电泳结束,关闭电源,取出凝胶,在紫外灯下观察电泳条带。
2.实验结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
bp
9416
6557
4361
2000
图试剂盒法提取黄色粘球菌染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳
泳道2与泳道14 加的样品是λ/ Hin dⅢmarker。
这个marker是用来显示分子量大的DNA条带。
λDNA的大小为48502bp,有7个Hin dⅢ的酶切位点,因此可以被Hin dⅢ酶切出8个片段。
片段长度分别为125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp和23130bp。
125bp和564bp的条带没有出现不是由于0.8%胶的分辨率问题,考虑到DL2000 marker的100bp的条带可以看见,所以125bp和564bp的片段没有出现的原因是由于λ DNA的这两条带浓度低(同样上样量为
5μL,λ DNA 分子量为48502bp,而DL2000 marker分子量为4600bp,加入同样
的体积后,λ DNA的564bp条带的量少于DL2000 marker 250bp条带的量),EB
染色较浅而看不清。
而4361bp这条带较弱是由于23130bp片段末端和4361bp
末端可以通过氢建相连形成粘性末端,而导致4361bp片段量减少而显得十分弱。
并且0.8%的胶分辨不出大于12kb的条带,所以23130bp的marker已经不准确了。
泳道2的marker跑得不直可能因为梳子不光滑。
泳道8加的样品是DL2000 marker,这个marker是用来显示分子量小的DNA条带。
片段长度分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。
泳道1是λmarke r,由于λDNA的大小为48502bp,远大于0.8%胶的分辨率,所以DNA电泳也不能准确定位起条带的位置(其条带48502bp甚至跑到了λ/ Hin d Ⅲmarker 23130bp的前面)。
这条带的亮度低于23130bp的marker是因为点样量所含λDNA少于λ/ Hin dⅢmarker中所含DNA(即DNA浓度低);条带窄则有两个原因:①DNA浓度低;②DNA条带少,λDNA只有一条大小为48502bp的条带,而λ/ Hin dⅢmarker中的23130bp条带由于其末端和4361bp末端可以通过氢建相连形成粘性末端而使部分23130bp条带增长为27490bp,使得条带变宽。
每组的DNA目的条带位置都与λmarker相近,可以推测黄色粘球菌DK1622的染色体DNA的断裂片段大多数集中在在48502bp上下(大于12000bp,小于一定数值)。
由于0.8%的胶分辨问题而不能准确定位目的片段DNA位置。
在同一泳道上条带与条带之间有很连续均匀很弱的长带,此处DNA片段大小介于两条条带之间,是含量少的DNA碎片。
这种碎片在用到4、6和7较为明显。
每组在加样孔下方都存在较窄的DNA条带,据推测,这种条带的产生是由于黄色粘球菌DK1622的染色体DNA太大,全长9.13Mb,有些菌的DNA没有破碎或只有小片段脱离,此带即为没有破碎的或只有小片段脱离的DNA,由于DNA 的片段太大,而0.8%的胶的孔径大小有限,因此,这种过大的DNA电泳速率极慢或者无法穿过琼脂糖凝胶的孔径,所以他们所在位置就在是导致他们的位置在上样孔下方。
个别组在上样孔处也存在较弱的DNA条带,是因为没有除尽的蛋白质把加样孔堵住了,导致少数DNA无法从加样孔跑到凝胶当中去。
这种现象在泳道4、6和7较为明显。
本组所提的染色体DNA在泳道11,目的片段条带亮度很弱,说明我们在提取染色体DNA的过程中DNA的损耗较大。
可能的原因有:①离心机不好用,沉淀细菌不充分;②高速离心沉淀细胞后,吸去上清液时由于黄色粘球菌很粘稠,将部分细菌也吸走了;③裂解不充分,要保证加入BTL buffer后,充分涡旋直至观察不到细胞沉淀;④洗脱液加入位置不正确,没有加到硅胶模中心部位;⑤洗脱时间过短,加入洗脱液后静置时间不够长;⑥除去残留乙醇不充分,由于乙醇比缓冲液轻,如果上样液中有乙醇,在点样的时候就容易把DNA连同一起带出来;点样速率太快而导致样品被吹悬起来。
3.讨论
1.黄色粘球菌因为含有黄色色素而导致菌液呈黄色。
2.向菌体沉淀中加入500μL TE ,TE溶液是Tris-HCl和EDTA (pH 8.0)混合液,Tris-HCl作为pH缓冲液,为细胞提供适宜酸碱环境,EDTA(pH 8.0时溶于水)是重要金属螯合剂,可以与Mg2+、Ca2+等金属络合,抑制DNase对DNA的降解作用。
此步骤加入TE后重悬菌液,使细菌细胞结构保持完整。
加入TE离心还可以进一步出去LB液体培养基的杂质。
3.向菌体沉淀中加入200μL BTL buffer后菌液变清亮而且有气泡产生。
据推测BTL buffer里面含有SDS、盐离子(Na+、K+)、核酸酶抑制剂和适宜的pH值。
①SDS 能断裂分子内和分子间氢键,使分子去折叠,从而破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构而达到裂解细胞的目的;SDS还是一种表面活性剂,具有亲水和亲友基团,因此Ep管中会产生气泡(产生水包油或油包水的气泡);②盐离子(Na+、K+)中和DNA的负电荷,防止DNA跟着细胞碎片一起沉淀;③核酸酶抑制剂可以抑制DNA酶的活性,保证DNA结构的完整;④适宜的pH值是为下一步加入的proteinase K做准备,保持proteinase K的活性。
4. 向菌液中加入25μL proteinase K的目的是消化菌体溶液中的蛋白质,但不能消化RNase A,而达到除去杂质蛋白质的目的。
涡旋、水浴和震荡混匀都是为了充分消化蛋白质。
proteinase K消化蛋白质的最适温度是55℃。
5. 向菌液中加入5μLRNase A是为了出去裂解液中的杂质RNA,水浴是为了充分消化RNA。
RNase A消化RNA的最适温度是37℃。
6. 加入220μL BDL buffer,颠倒混匀后在溶液上方产生黄色絮状沉淀(RNase A
和proteinase K)。
BDL buffer是含有高浓度NaCl的溶液,可以使蛋白质盐析形成沉淀,而DNA可以溶于盐溶液(DNA溶解度在NaCl浓度为0.14mol/L时最低,2mol/L最高)。
本次试验我们组提出的DNA含量很少,可能因为我们组的DNA 在盐溶液中部分盐析了。
(疑问:为何没有离心盐析的蛋白质,反而在下一步溶解它呢,难道是因为这一步的目的是:使蛋白质变性后失去与DNA结合的能力,在后面几步中吸附柱上吸附的DNA没有蛋白质缠绕,从而通过离心将蛋白质甩到滤液中。
)
7.65℃水浴可以促进DNA的溶解,此时沉淀消失,溶液清亮透明。
8. 加入220μL 无水乙醇后,乙醇浓度为33%左右,此步骤作用推测:是乙醇和有机物的溶解性大于有机物和DNA的溶解性而将溶液中的DNA和有溶液中的机
物分开,有利于下一步纯化柱吸附无杂质的DNA。
9.蓝色的纯化柱可以吸附DNA而将其他杂质过滤掉。
10.据推测加入500μL buffer HB的目的是洗涤DNA。
buffer HB的可能成分是有机溶剂,除去杂质中的有机物。
11. 据推测加入700μL wash buffer的目的也是洗涤DNA和上一步加入的buffer HB,wash buffer的可能成分是一定浓度的乙醇。
12. 加入50μL 65℃预热的Elution Buffer的目的是将DNA从纯化柱上洗脱下来,DNA在65℃时溶解度很高。
Elution Buffer的可能是TE(pH=8)和NaCl(盐浓度在
2mol/L左右)的混合液。
加入Elution Buffer时要对准吸附柱(纯化柱)的吸附面,使DNA完全浸没在液体中,室温静置5min使DNA与Elution Buffer充分接触,提高洗涤效率。
13.在选择琼脂糖凝胶浓度的时候不能因为DNA的分子量太大而用琼脂糖含量过低的胶,因为当琼脂糖含量少于0.5%时,凝胶很脆弱,加样的时候容易将凝胶戳破。
14.按照0.8%的琼脂糖含量配胶的时候,40mL 1×TAE应当加入琼脂0.32g,而实际操作中只加入了0.3g,是因为在加热融化琼脂糖的时候多少会有水蒸气挥发而导致琼脂糖凝胶浓度偏高。
15.在用微波炉加热琼脂糖溶液时要盖上红盖子,防止水蒸气挥发过多而导致胶的浓度和预期相差过大,但不要拧紧盖子,防止瓶子在加热过程中炸裂。
16.EB在配置琼脂糖溶液的时候加而不是在在混合上样液时加入是因为EB中插入DNA的部分带正电荷,在电场运动方向与DNA运动方向相反,如果在混合上样液时加入EB会对电泳时DNA与EB的结合产生不利影响,最终导致DNA条带在紫外灯下显色不明显。
17. λ/ HindⅢmarker的条带由上至下亮度变暗有两个原因:①上方的条带DNA 分子量大,插入的EB多,显色明显;②EB在电泳时向上样孔方向移动,由正极向负极浓度变高,所以距离上样孔近的条带更亮。
18.DNA电泳时条带跑得不平整原因可能有:①加样量太多;②梳子不光滑。
19.本实验使用的细菌为革兰氏阴性菌,细胞壁含肽聚糖很少,所以没有使用试剂盒里面的溶菌酶破坏黄色粘球菌的细胞壁。
而革兰氏阴性菌细胞内脂类物质含量高,所以用SDS(表面活性剂)就能破坏该细菌的细胞壁。
参考文献
汪天虹.分子生物学实验.北京:北京大学出版社,2009年.。