细菌染色体DNA的提纯与纯化

细菌染色体DNA的提纯、纯化与电泳检测

摘要

本实验用试剂盒 Bacterial DNA isolation kit(Omega) 提取黄色粘球菌DK1622的染色体DNA, 并且通过一系列的分离纯化技术将其染色体DNA与RNA、蛋白质、脂类、碳水化合物等杂质分开从而得到纯化的染色体DNA分子。通过琼脂糖凝胶电泳的方法可以分析所提取染色DNA的量的多少，纯化结果如何，以及杂带产生的原因，从而在今后的实验中完善实验方法，严谨实验步骤。

关键词

黄色粘球菌试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)琼脂糖凝胶电泳

引言

黄色粘球菌DK1622是一种特殊的细菌，它不含质粒DNA，只含染色体DNA，所以用试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)提取的是他的染色体DNA。此外，它还有其他特性：基因组全长9.13Mb，代时4小时，胞外基质富含粘多糖等。

生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。真核细胞的DNA 主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合，因此，黄色粘球菌DK1622的染色体DNA是裸露的，不与任何组蛋白结合。

染色体DNA的提取一般包括：①破碎细胞；②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子；③沉淀核酸；④去除盐类、有机溶剂等杂质；⑤纯化干燥；⑥溶解等几个主要步骤。破碎细胞是为了释放DNA，其方法因样本不同而不同，可用反复冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程，因此，在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。一般去除蛋白质常用酚／氯仿抽提法。酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响，经酚／氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相。这种方法对于去除DNA中大量的蛋白质杂质是行之有效的，因此也是DNA纯化中的基本方法。少量的或与DNA紧密结合的蛋白质杂质则可用蛋白酶予以去除。DNA制品中也会有RNA 杂质，但RNA极易降解。况且，少量的RNA对DNA操作无大影响，必要时可加入不含DNase的RNase以去除RNA的污染。为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是利用冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心将核酸回收。用70%~80%乙醇洗涤沉淀，可除去沉淀中多余的盐，以避免其对核酸溶解的影响以及对后续步骤的酶促反应的抑制作用。

由于染色体DNA一般都很长，对剪切力十分敏感，提取时容易发生机械断裂，产生大小不同的片段。因此，在染色体DNA提取过程中，为保证得到较长的DNA，应尽量避免以下因素导致的DNA降解：

（1）物理降解。在实际操作时应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移和剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA的损伤，同时也应避免过高的温度。此外，操作所用的吸头口不能太小，应剪去尖端部分，使其孔径变大。

（2）细胞内源DNase的作用。细胞内常存在活性很高的DNase，细胞破碎后，DNase便可与DNA接触并使之降解。为了避免DNase的作用，在溶液中常加入EDTA、SDS以及蛋白酶等。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的辅助因子。SDS和蛋白酶则分别具有使蛋白质变性和降解的作用。

（3）化学因素也会降解DNA。例如，过酸的条件下，由于DNA存在腺嘌呤而导致DNA的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂。因此，在DNA提取过程中，应避免采用过酸条件。

不同生物（植物、动物、微生物）的染色体DNA的提取方法有所不同。目前，也有许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离到高纯度的DNA。本实验用试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega) 提取黄色粘球菌DK1622的染色体DNA。

电泳（electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质，具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。

正文

1.材料和方法

1.1 材料和试剂

实验材料：黄色粘球菌DK1622

实验试剂：试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)：TE溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA (pH 8.0)）、BTL buffer、proteinase K、RNase A、BDL buffer、buffer HB、wash buffer、无水乙醇、Elution Buffer、琼脂糖、灭菌双蒸水ddH2O、50×TAE缓冲液、10mg/mL溴化乙锭（EB）溶液、6×上样缓冲液（6×loading buffer）。

1.2实验方法

1.黄色粘球菌DK1622的培养与增值

将32℃，200rpm的震荡培养的黄色粘球菌DK1622产物的1%接种于新的LB液体培养基中，在32℃，200rpm的震荡培养20小时。

2.实验前准备

打开水浴锅的三个开关，将温度分别调整到37℃、65℃和55℃。

3. 黄色粘球菌DK1622菌体的收集

（1）将黄色粘球菌培养液倒入1.5mL Ep管中，10,000rpm离心2min，弃上清；（2）继续倒入黄色粘球菌培养液于上1.5mL Ep管中，10,000rpm离心2min，使1.5mL Ep管中共收集3.0mL培养液中的菌体；

（3）向菌体沉淀中加入500μL TE，充分涡旋重悬；

（4）将菌液在离心机中10,000rpm离心2min，尽可能吸弃上清；

4.黄色粘球菌DK1622菌体的裂解

（1）向菌体沉淀中加入200μL BTL buffer，涡旋重悬；

（2）向菌液中加入25μL proteinase K溶液，涡旋混匀；

（3）将菌液55℃水浴45min，期间每15～20min振荡混匀一次；

（4）向菌液中加入5μL RNase A，颠倒混匀；

（5）将菌液放置在水浴锅中37℃水浴30min。

（6）将菌液在12,000rpm离心5min，沉淀不溶性细胞碎片；

（7）小心转移上清到一新的Ep管中；

（8）加入220μL BDL buffer，颠倒混匀；

（9）65℃水浴10min；

（10）加入220μL 无水乙醇，充分涡旋，确保没有任何沉淀；

（11）将DNA纯化柱（蓝色）组装到2mL收集管上；

（12）将上述样品全部、小心转移到柱子中；

（13）12,000rpm离心1min，弃流出液；

（14）将柱子组装到第二个收集管上，加入500μL buffer HB；

（15）12,000rpm离心1min，弃流出液；

（16）将柱子组装到同一个收集管上，加入700μL wash buffer；

（17）12,000rpm离心1min，弃流出液；

（18）再加入700μL wash buffer，12,000rpm离心1min，弃流出液；

（19）使用同一收集管，13,000rpm离心2min，除去残留的乙醇；

（20）将柱子安装到新的Ep管上，加入50μL 65℃预热的Elution Buffer，室温静置5min；

（21）将Ep管12,000rpm离心1min，收集DNA；

（22）再将Ep管12,000rpm离心1min，重复收集一次DNA。

5.0.8% 琼脂糖凝胶的制备

（1）配制2L 1×TAE：取40mL 50×TAE，用双蒸水将其稀释至2L；

（2）正确组装制胶槽、制胶板、样品梳；

（3）取40mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称量0.3g琼脂糖，混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒；

（4）待溶液冷却至60℃左右，加入20μL 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5mg/mL，混匀后倒入制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。

6.电泳上样

（1）取1.0μL纯化DNA、4μL双蒸水、1μL上样缓冲液（6×loading buffer），用微量移液器吹吸混匀；

（2）将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm；