4 非无菌产品微生物检查：控制菌检查法
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促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
大肠埃希菌
麦康凯肉汤 麦康凯琼脂
大肠埃希菌
麦康凯肉汤
麦康凯琼脂
促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 促生长能力+指示 大肠埃希菌
培养基适用性检查
沙门菌 RV沙门菌增菌肉汤 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 三糖铁琼脂培养基 铜绿假单胞菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂 促生长能力 抑制能力 促生长能力 +指示特性 指示能力 促生长能力 抑制能力 促生长能力 +指示特性 抑制能力 促生长能 促生长能力 生孢梭菌 乙型副伤寒沙门菌 金黄色葡萄球菌 乙型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌
培养基适用性试验
培养基是绝大多数微生物试验的基础其质量是微生物试验成功关键因素。 适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保 证。
培养基适用性试验
培养基的配制 可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培 养基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质 控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能使用，确 保培养基的质量符合要求。
划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，置 30～35℃，培养18～24小时。 平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性
耐胆盐革兰阴性菌检查 定量试验 1、取定量供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌 增菌肉汤中。 30～35℃，培养24～48小时。 2、上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄 糖琼脂平板上。 30～35℃，培养18～24小时。 若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴 性。根据各培养管检查结果，从表2查对1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴 性菌的最大可能数。
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法
概述
控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物 。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按
规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法， 但必须证明替代方
法等效于药典规定的检查方法。
培养基适用性检查
培养基抑制能力检查 接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基。不短于规定的最长培养时间下培养。 试验菌应不得 生长。 培养基指示特性检查 取试验菌悬液各0.1ml涂布于培养基平板上在不长于规定的最短时间下培养， 验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 被检培养基上试
方法适用性试验
修订前 取1:10供试液至胆盐乳糖增菌（大肠、金葡）18-24h MUG培养基（大肠）5h、24h MaC琼脂（大肠 、指示） 18-24h 修订后 取1:10供试液至TSB（大肠、 金葡、）18-24h MaC肉汤 （大肠、 金葡）42-44 ℃ 24-48h MaC 琼脂 （大肠 ）18-72h
培养基适用性检查
成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基 的适用性检查。 促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。 菌株见表
培养基适用性检查
控制菌检查
培养基
特性
试验菌株
耐胆盐革兰阴性菌
肠道菌增菌肉汤
促生长能力
紫红胆盐葡萄糖琼脂
大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 促生长能力+指示特性 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌
供试品检查—— 沙门菌
沙门菌为革兰阴性杆菌，无芽孢，菌体 通常（0.4～ 0.9）μ m×(1～3) μ m，两 端钝圆。需氧或兼性厌 氧，10～42℃皆可 生长，最适温度37℃。
沙门菌检查 检验程序 修订前
营养肉汤供试液（18-24h ) TTB (沙门、金葡） 18-24h SS / MaC 琼脂（沙门、金-）18-48h RV 氯化镁孔雀绿沙门菌增菌肉汤 XLD 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 SS： 沙门、志贺菌属琼脂 XLD 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 修订后 TSB 供试液（ 18-24h ） RV肉汤（沙门、金葡）18-24h XLD琼脂（沙门、 指示）18-48h
金黄色葡萄球菌、Biblioteka 白色念珠菌替代法的应用原则
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法
等效于药典规定的检查方法。
收载方式及结果判断方式
修订前 增菌、分离(纯化)、生化试验 适宜的鉴定试验。 修订后 增菌、分离(纯化)、生化试验
其它适宜方法进一步鉴定。
培养基适用性试验
修订内容 控制菌检查用培养基数量减少7个；在增菌过程，使用无选择性增菌培养 基培养 理由 污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损伤，使用无选择性增 菌培养基培养，使受损伤的细菌得到修复，提高检出率。
培养基适用性检查试验
再验证 ⒈如果其中有任一控制点发生变化,应重新进行培养基适用性检查。 ⒉当检验结果出现异常或实验室质量控制需要，也可通过培养基适 用性检查提供一定依据。
培养基适用性检查
⒈固体培养基或原料变质不应使用；配制培养基储存过程中发现 浑浊、变色、 有菌生长、严重脱水等变化不应再使用。 ⒉不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适用性试验确定。 ⒊除特殊规定外，培养基配制采用蒸馏水或纯化水，但应进行检测控制，如蒸 馏水pH值应为5～7。 ⒋尽量临用现配。
金黄色葡萄球菌
甘露醇氯化钠琼脂
梭菌
梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂
白色念珠菌 沙氏葡萄糖肉汤
沙氏葡萄糖琼脂 念珠菌显色培养基
促生长能力 白色念珠菌 +指示特性 促生长能力白 色念珠菌 促生长能力 白色念珠菌 +指示能力 抑制能力 大肠埃希菌
培养基适用性检查
液体培养基促生长能力检查 接种不大于100cfu的试验菌在不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基管试验菌应生长 良好。 固体培养基促生长能力 接种取菌悬液0.1ml），涂布于培养基平板上，在规定的温度及时间下培养 。 不长于规定的最 短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形 态特征应一致。
表2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数
各供试品量的检查结果 0.1g/ml ＋ 0.01g/ml ＋ 0.001g/ml ＋ 每1g（或1ml）供试品中
可能的菌数（N）
N＞103
＋
＋ －
＋
－ －
－
－ －
102＜N＜103
10＜N＜102 N＜10
供试品检查—大肠埃希菌
大肠埃希菌是肠杆菌科埃希菌属的代表种。 大肠埃希菌是两端钝圆的短小直杆菌，（1.1～1.5）m×(2.0～ 6.0)μ m单个或成 对，革兰阴性无芽孢，多有鞭毛培养最适温度为37℃可在15-46℃生长，兼性厌氧 。
培养基适用性检查
配制培养基的保存 ⒈培养基灭菌后，不得在高压锅内过夜；
⒉固体培养基灭菌或融化后，放置不得超过8h；
⒊培养基于2～25 ℃保存，但不应超过21 d； ⒋固体琼脂培养基 熔化再使用应不超过1次。
菌种及菌液制备 菌种来源 国内外认可的菌种保藏中心。
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心 获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 乙型副伤寒沙门菌 白色念珠菌 生孢梭菌 〔CMCC（B）26 003〕 〔CMCC（B）10 104〕 〔CMCC（B）44 102〕 〔CMCC（B）50 094〕 〔CMCC（F）98 001 〔CMCC（B）64 941
大肠埃希菌检查
检验程序 取供试品，照附录“微生物计数法”制成1：10供试液。 取相当于1g或1mL供试品的供试液，接种至适宜体积 的胰酪大豆胨肉汤中。 30～35℃培养18 ～24小时。 取上述预培养物1mL接种至100mL麦康凯肉汤中。 42～44℃培养24～48小时。 取麦康凯肉汤培养物划线接种于麦康凯琼脂平 板上。30～35℃培养18～72小时。结果判断 -若麦康凯琼脂平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试 验, 确证是否为大肠埃 希菌； -若麦康凯琼脂平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结 果为阴性，判供试品未检出大 肠埃希菌。
概述
微生物限度检查法中的控制菌检查在药典一、二、三部附录中内容基本一致 参照ICH协调案”非无菌药品微生物限度检查：控制菌检查”进行修订。 主要修订内容 控制菌检查项目、培养基体系、 培养基适用性检查、 检查方法适用性试验、
结果判断等。
控制菌检查法
供试液制备及实验环境要求 -同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》。 -如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。 -中和剂或灭活剂的使用 使用了中和剂或灭活剂应确认有效性及对微生物的无毒 性并应确认供试液 与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。
菌悬液的贮存 若在室温下放置，应在2小时内使用； 若保存在2～8℃，可在24小时内使用。 生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定的孢子悬液可保 存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
阴性对照试验 确认试验条件是否符合要求。 稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。 供试品检查时也需进行阴性对照试验。如果阴性对照有菌生长，应 进行偏差调 查。
增修订内容
收载方式
检验项目
替代法的应用原则 结果判断方式
收载方式
修订前 微生物限度检查 修订后 非无菌产品微生物检查：微生物计数法 非无菌产品微生物检查：控制菌检查法 非无菌药品微生物限度标准
检验项目
修订前 大肠杆菌、 大肠菌群、 梭菌、 修订后 大肠杆菌、 耐胆盐革兰阴性菌、 梭菌、 沙门菌、 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 沙门菌、 铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌
菌液制备
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌 胰酪大豆胨肉汤或在胰酪大豆胨琼脂30～35℃，18～24h 白色念珠菌 沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤20℃～25℃， 2～3天 生孢梭菌梭菌增菌培养基30～35℃，置厌氧条件下培养24～48小时
菌液制备 菌悬液的制备 稀释剂 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。
供试品检查 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。 阳性对照试验 试验方法 同供试品的控制菌，加菌量应不大于100cfu。 应检出相应的控制菌。
供试品检查—耐胆盐革兰阴性菌
耐胆盐革兰阴性菌取代2010年版大肠菌群检查 大肠菌群的定义 是指在37℃生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或 兼性厌氧的无芽孢杆菌。 符合上述定义的菌除埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷 伯菌属。
方法适用性试验—结果判断
修订前 若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的检查； 若未检出试验菌，应采用培养基稀释 法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或 联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。 修订后 若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的检查； 若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性。 如确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该 供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。
耐胆盐革兰阴性菌检查
检验程序 供试液制备 同“非无菌产品微生物检查：微生物计数法制成1：10供试液，混匀。 预培养 在20～25℃培养，培养时间一般2小时,使供试品中的细菌充分恢复但不增殖。
未检出试验 取相当于1g或1mL供试品的上述预培养物接种至 肠道菌增菌肉汤中。
30～35℃，培养24～48小时。
方法适用性试验—试验菌
修订前 大肠菌群的验证，采取大肠埃希菌为验证菌株。 修订后 耐胆盐革兰阴性菌检查方法，采取大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。
方法适用性试验
修订前验证方法 取规定量供试液及10 ～100cfu试验菌接入增菌培养基中依相应的控制菌检查方法进行检 查。 当采用薄膜过滤时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中， 过滤后，注入增菌培养基或取出接入增菌培养基中. 修订后适用性试验 按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中； 采用薄膜过滤时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过 滤 ,注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。 依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应 的反应特征
大肠埃希菌
麦康凯肉汤 麦康凯琼脂
大肠埃希菌
麦康凯肉汤
麦康凯琼脂
促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 促生长能力+指示 大肠埃希菌
培养基适用性检查
沙门菌 RV沙门菌增菌肉汤 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 三糖铁琼脂培养基 铜绿假单胞菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂 促生长能力 抑制能力 促生长能力 +指示特性 指示能力 促生长能力 抑制能力 促生长能力 +指示特性 抑制能力 促生长能 促生长能力 生孢梭菌 乙型副伤寒沙门菌 金黄色葡萄球菌 乙型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌
培养基适用性试验
培养基是绝大多数微生物试验的基础其质量是微生物试验成功关键因素。 适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保 证。
培养基适用性试验
培养基的配制 可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培 养基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质 控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能使用，确 保培养基的质量符合要求。
划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，置 30～35℃，培养18～24小时。 平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性
耐胆盐革兰阴性菌检查 定量试验 1、取定量供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌 增菌肉汤中。 30～35℃，培养24～48小时。 2、上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄 糖琼脂平板上。 30～35℃，培养18～24小时。 若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴 性。根据各培养管检查结果，从表2查对1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴 性菌的最大可能数。
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法
概述
控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物 。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按
规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法， 但必须证明替代方
法等效于药典规定的检查方法。
培养基适用性检查
培养基抑制能力检查 接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基。不短于规定的最长培养时间下培养。 试验菌应不得 生长。 培养基指示特性检查 取试验菌悬液各0.1ml涂布于培养基平板上在不长于规定的最短时间下培养， 验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 被检培养基上试
方法适用性试验
修订前 取1:10供试液至胆盐乳糖增菌（大肠、金葡）18-24h MUG培养基（大肠）5h、24h MaC琼脂（大肠 、指示） 18-24h 修订后 取1:10供试液至TSB（大肠、 金葡、）18-24h MaC肉汤 （大肠、 金葡）42-44 ℃ 24-48h MaC 琼脂 （大肠 ）18-72h
培养基适用性检查
成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基 的适用性检查。 促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。 菌株见表
培养基适用性检查
控制菌检查
培养基
特性
试验菌株
耐胆盐革兰阴性菌
肠道菌增菌肉汤
促生长能力
紫红胆盐葡萄糖琼脂
大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 促生长能力+指示特性 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌
供试品检查—— 沙门菌
沙门菌为革兰阴性杆菌，无芽孢，菌体 通常（0.4～ 0.9）μ m×(1～3) μ m，两 端钝圆。需氧或兼性厌 氧，10～42℃皆可 生长，最适温度37℃。
沙门菌检查 检验程序 修订前
营养肉汤供试液（18-24h ) TTB (沙门、金葡） 18-24h SS / MaC 琼脂（沙门、金-）18-48h RV 氯化镁孔雀绿沙门菌增菌肉汤 XLD 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 SS： 沙门、志贺菌属琼脂 XLD 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 修订后 TSB 供试液（ 18-24h ） RV肉汤（沙门、金葡）18-24h XLD琼脂（沙门、 指示）18-48h
金黄色葡萄球菌、Biblioteka 白色念珠菌替代法的应用原则
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法
等效于药典规定的检查方法。
收载方式及结果判断方式
修订前 增菌、分离(纯化)、生化试验 适宜的鉴定试验。 修订后 增菌、分离(纯化)、生化试验
其它适宜方法进一步鉴定。
培养基适用性试验
修订内容 控制菌检查用培养基数量减少7个；在增菌过程，使用无选择性增菌培养 基培养 理由 污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损伤，使用无选择性增 菌培养基培养，使受损伤的细菌得到修复，提高检出率。
培养基适用性检查试验
再验证 ⒈如果其中有任一控制点发生变化,应重新进行培养基适用性检查。 ⒉当检验结果出现异常或实验室质量控制需要，也可通过培养基适 用性检查提供一定依据。
培养基适用性检查
⒈固体培养基或原料变质不应使用；配制培养基储存过程中发现 浑浊、变色、 有菌生长、严重脱水等变化不应再使用。 ⒉不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适用性试验确定。 ⒊除特殊规定外，培养基配制采用蒸馏水或纯化水，但应进行检测控制，如蒸 馏水pH值应为5～7。 ⒋尽量临用现配。
金黄色葡萄球菌
甘露醇氯化钠琼脂
梭菌
梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂
白色念珠菌 沙氏葡萄糖肉汤
沙氏葡萄糖琼脂 念珠菌显色培养基
促生长能力 白色念珠菌 +指示特性 促生长能力白 色念珠菌 促生长能力 白色念珠菌 +指示能力 抑制能力 大肠埃希菌
培养基适用性检查
液体培养基促生长能力检查 接种不大于100cfu的试验菌在不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基管试验菌应生长 良好。 固体培养基促生长能力 接种取菌悬液0.1ml），涂布于培养基平板上，在规定的温度及时间下培养 。 不长于规定的最 短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形 态特征应一致。
表2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数
各供试品量的检查结果 0.1g/ml ＋ 0.01g/ml ＋ 0.001g/ml ＋ 每1g（或1ml）供试品中
可能的菌数（N）
N＞103
＋
＋ －
＋
－ －
－
－ －
102＜N＜103
10＜N＜102 N＜10
供试品检查—大肠埃希菌
大肠埃希菌是肠杆菌科埃希菌属的代表种。 大肠埃希菌是两端钝圆的短小直杆菌，（1.1～1.5）m×(2.0～ 6.0)μ m单个或成 对，革兰阴性无芽孢，多有鞭毛培养最适温度为37℃可在15-46℃生长，兼性厌氧 。
培养基适用性检查
配制培养基的保存 ⒈培养基灭菌后，不得在高压锅内过夜；
⒉固体培养基灭菌或融化后，放置不得超过8h；
⒊培养基于2～25 ℃保存，但不应超过21 d； ⒋固体琼脂培养基 熔化再使用应不超过1次。
菌种及菌液制备 菌种来源 国内外认可的菌种保藏中心。
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心 获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 乙型副伤寒沙门菌 白色念珠菌 生孢梭菌 〔CMCC（B）26 003〕 〔CMCC（B）10 104〕 〔CMCC（B）44 102〕 〔CMCC（B）50 094〕 〔CMCC（F）98 001 〔CMCC（B）64 941
大肠埃希菌检查
检验程序 取供试品，照附录“微生物计数法”制成1：10供试液。 取相当于1g或1mL供试品的供试液，接种至适宜体积 的胰酪大豆胨肉汤中。 30～35℃培养18 ～24小时。 取上述预培养物1mL接种至100mL麦康凯肉汤中。 42～44℃培养24～48小时。 取麦康凯肉汤培养物划线接种于麦康凯琼脂平 板上。30～35℃培养18～72小时。结果判断 -若麦康凯琼脂平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试 验, 确证是否为大肠埃 希菌； -若麦康凯琼脂平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结 果为阴性，判供试品未检出大 肠埃希菌。
概述
微生物限度检查法中的控制菌检查在药典一、二、三部附录中内容基本一致 参照ICH协调案”非无菌药品微生物限度检查：控制菌检查”进行修订。 主要修订内容 控制菌检查项目、培养基体系、 培养基适用性检查、 检查方法适用性试验、
结果判断等。
控制菌检查法
供试液制备及实验环境要求 -同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》。 -如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。 -中和剂或灭活剂的使用 使用了中和剂或灭活剂应确认有效性及对微生物的无毒 性并应确认供试液 与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。
菌悬液的贮存 若在室温下放置，应在2小时内使用； 若保存在2～8℃，可在24小时内使用。 生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定的孢子悬液可保 存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
阴性对照试验 确认试验条件是否符合要求。 稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。 供试品检查时也需进行阴性对照试验。如果阴性对照有菌生长，应 进行偏差调 查。
增修订内容
收载方式
检验项目
替代法的应用原则 结果判断方式
收载方式
修订前 微生物限度检查 修订后 非无菌产品微生物检查：微生物计数法 非无菌产品微生物检查：控制菌检查法 非无菌药品微生物限度标准
检验项目
修订前 大肠杆菌、 大肠菌群、 梭菌、 修订后 大肠杆菌、 耐胆盐革兰阴性菌、 梭菌、 沙门菌、 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 沙门菌、 铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌
菌液制备
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌 胰酪大豆胨肉汤或在胰酪大豆胨琼脂30～35℃，18～24h 白色念珠菌 沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤20℃～25℃， 2～3天 生孢梭菌梭菌增菌培养基30～35℃，置厌氧条件下培养24～48小时
菌液制备 菌悬液的制备 稀释剂 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。
供试品检查 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。 阳性对照试验 试验方法 同供试品的控制菌，加菌量应不大于100cfu。 应检出相应的控制菌。
供试品检查—耐胆盐革兰阴性菌
耐胆盐革兰阴性菌取代2010年版大肠菌群检查 大肠菌群的定义 是指在37℃生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或 兼性厌氧的无芽孢杆菌。 符合上述定义的菌除埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷 伯菌属。
方法适用性试验—结果判断
修订前 若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的检查； 若未检出试验菌，应采用培养基稀释 法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或 联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。 修订后 若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的检查； 若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性。 如确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该 供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。
耐胆盐革兰阴性菌检查
检验程序 供试液制备 同“非无菌产品微生物检查：微生物计数法制成1：10供试液，混匀。 预培养 在20～25℃培养，培养时间一般2小时,使供试品中的细菌充分恢复但不增殖。
未检出试验 取相当于1g或1mL供试品的上述预培养物接种至 肠道菌增菌肉汤中。
30～35℃，培养24～48小时。
方法适用性试验—试验菌
修订前 大肠菌群的验证，采取大肠埃希菌为验证菌株。 修订后 耐胆盐革兰阴性菌检查方法，采取大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。
方法适用性试验
修订前验证方法 取规定量供试液及10 ～100cfu试验菌接入增菌培养基中依相应的控制菌检查方法进行检 查。 当采用薄膜过滤时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中， 过滤后，注入增菌培养基或取出接入增菌培养基中. 修订后适用性试验 按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中； 采用薄膜过滤时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过 滤 ,注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。 依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应 的反应特征