耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化
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1 材料与方法
1.1 样品采集 试验样品：土壤采自大庆扎龙湿地和腐殖质
丰富森林地区。 1.2 试验材料
① 富集培养基：蛋白胨 5 g，滤纸 5 g，NaCl
0.5 g，酵母粉 2 g，CaCO3 2 g，蒸馏水 1 000 mL， 121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。
② 基础产酶培养基：羧甲基纤维素钠 15 g， MgSO4 2 g，KH2PO4 2 g，NH4NO3 1 g，NaCl 0.3 g， MnSO4 2.2 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，酵母粉 1 g，蒸馏 水 1 000 mL，121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。
④ PDA 培养基：取新鲜马铃薯 300 g，新鲜马 铃薯洗净去除外皮，切丁，加适量蒸馏水开水煮 30 min，滤去残渣，取浸出液冷却至室温，再加入 25 g 葡萄糖和 15 g 琼脂，蒸馏水定容至 1 000 mL， pH 自然。121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。 1.3 方法 1.3.1 菌种筛选与鉴定
ment for the Utilization of Agricultural Renewable Resources, Harbin 150030, China)
Abstract: Low temperature was key factor restricting high continuous efficiency conversion of
University, Harbin 150030, China; 2. Key Laboratory of Pig-breeding Facilities Engineering, Mini-
stry of Agriculture, Harbin 150030, China; 3. Heilongjiang Key Laboratory of Technology and Equip-
摘 要：低温是制约北方寒冷地区秸秆生物持续、高效转化的主要因素，也是影响北方寒区沼气发酵全年持
续运行的关键因素。研究以秸秆利用富集限制性培养技术，从腐殖质丰富的大庆扎龙湿地土样中筛选出 1 株产生
较高纤维素酶的耐低温降解纤维素菌株，经菌株 18S rDNA 序列及形态学分析，鉴定该菌株为奥尔森青霉属，命
第 50 卷 第 2 期
东北农业大学学报
50(2): 79~89
2019 年 2 月
Journal of Northeast Agricultural University
February 2019
网络出版时间 2019-3-9 16:51:45 [URL] http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20190309.1651.004.html
第2期
郑国香等：耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化
· 81 ·
使用真菌通用引物作 PCR 扩增[11]。扩增产物序列由
上海生工测定，结果与 NCBI 网站中标准菌种样品
序列对比匹配，利用 MEGA 软件构建菌株系统发
育树。
② 纤维素酶活（CMCase）测定方法：CMC 酶活
耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化
郑国香 1, 2, 3，艾 爽 1, 2，尹 婷 1, 3，李 健 1, 3
（ 1. 东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030；2. 农业部生猪养殖设施工程重点实验室，哈尔滨 150030； 3. 黑龙江省农业再生资源利用技术装备重点实验室，哈尔滨 150030 ）
straws, also limiting the continuous operation of biogas fermentation in cold regions of North China. A newly isolated low temperature-resistant strain was successfully isolated from humus-rich soil in Daqing Zhalong wetland region by restrictive cultures and was found to be a potential cellulase producer. The isolate was identified as Penicilliumon basis of 18S ribosomal DNA sequencing and morphological observation. The optimal conditions affecting the enzyme production of strain L-11 were obtained by response surface methodology (RSM). CMCase reached the maximum 48.809 IU·mL-1 under optimized conditions, which were bran 11.05 g · L-1, soybean flour 2.32 g · L-1, initial pH 5.23 and 2.30 g · L-1
名为 L-11。经响应曲面法优化产酶条件，获得影响奥尔森青霉菌株 L-11 产酶最优条件为麸皮 11.05 g·L-1、豆粉
2.32 g·L-1、初始 pH 5.23、卵磷脂 2.30 g·L-1，羧甲基纤维素酶活（CMCase）达 48.809 IU·mL-1。低温下菌株 L-11 具
有较强的纤维素降解能力，在沼气生产领域应用前景良好，可为高转化能力基因菌株改良及富含纤维素类废弃物
· 80 ·
东北农业大学学报
第 50 卷
lecithin, indicating a high potential cellulose-degradation capacity and its better application prospect in biogas utilization field under cold environment. It also provided important seed resources for the improvement of genetic strain with high conversion capacity and comprehensive utilization of cellulose waste.
目前报道中关于低温纤维素酶生产菌研究较 少。袁楠等筛选出一组低温纤维素降解菌系[5]。亢 宗静等研究若尔盖高原湿地低温真菌特征，发现 两株低温纤维素降解菌分别为白囊耙齿菌和烟曲 霉[6]。谢宇新等筛选出纤维素低温降解菌 D5 属于假 单胞菌属，在低温堆肥升温过程中起重要作用 。 [7] 因此，筛选产纤维素酶活性高，适应自然环境能 力强菌株，对纤维素资源降解利用意义重大[8-9]。本 研究利用限制性培养方法，在湿地土壤中筛选出耐 低温、高效解纤维素降解菌株，命名为 L-11，并以 其为研究对象，利用形态学研究方法和 18S rDNA 序 列分析确定菌株菌属，优化菌株产纤维素酶品质 及其影响酶活条件，为低温纤维素降解菌应用奠 定理论基础。
① 菌种分离筛选[10]：将土壤浸出液涂布于富集 培养基平板上，置于 15 ℃低温生化培养箱 7~10 d， 挑选出生长良好、形态明显不同菌落划线分纯， 得单菌落。分离纯化后，5 ℃低温条件下培养 13~ 15 d，选择生长良好菌落，质量分数 1%刚果红染 色液染色，洗去浮色后，根据水解圈直径挑选降 解能力强菌株。用无菌接种环取 2 环得到纯菌，接 入产酶培养液，15 ℃，120 r·min-1摇床培养箱培养 7 d 后测定纤维素酶活。同样接种量接种到纤维素 培养液，相同条件培养 7~10 d，观察菌株降解微晶 纤维素能力。综合以上结果，选择纤维素酶活力 高且微晶纤维素降解彻底菌株。取分离获得液体 培养纯菌 30 μL，点接于 PDA 平板中心处，15 ℃静 置培养 5~7 d，观察并记录不同菌落菌丝形状、颜 色、生长方式等形态和生长特征，根据不同菌属 形态描述判断菌株菌属。将分离纯菌接种至 PDA 平板上，15 ℃静置培养 5 d，扫描电镜观察其孢子 形态。采用分子生物学 18S rDNA 序列分析方法，
Key words: low temperature-resistant; cellulasபைடு நூலகம்; culture condition; response surface methodo-
logy
我国东北地区是植物木质纤维素储量最多地 区，寒冷条件使大量纤维素资源无法及时有效利 用与消耗[1]。因此，高效利用东北地区纤维素资源 成为生态环境、可再生能源等领域重要课题。微 生物降解法具有便捷、低成本、环境友好等特 性。寻找耐低温纤维素降解菌，优化其产酶环境 因子，使其秸秆转化降解性能达到最佳，可解决 东北地区秋冬寒冷气候造成纤维素资源难以利用 问 题 。 [2] 1887 年 Forster 发 现 在 微 生 物 0 ℃ 以 下 生 长，但直到 1902 年嗜冷菌概念方提出。Cousin 表 明最低生长温度在 0 ℃及以下，最适生长温度在 15 ℃，最高生长温度在 20 ℃微生物为耐低温或嗜 冷微生物[3]。随分子生物学技术及极端微生物概念 提出，耐低温微生物研究发展迅速[4]。
综合利用提供菌种资源。
关键词：耐低温；纤维素酶；培养条件；响应面优化
中图分类号：Q939.9
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2019）02-0079-11
郑国香, 艾爽, 尹婷, 等. 耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化[J]. 东北农业大学学报, 2019, 50(2): 79-89. DOI: 10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2019.2.0010 Zheng Guoxiang, Ai Shuang, Yin Ting, et al. Screen, identification and optimization of enzyme-producing conditions of a low temperature-resistant cellulose degradation strain[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2019, 50(2): 79-89. (in Chinese with English abstract) DOI: 10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2019.2.0010
Screen, identification and optimization of enzyme-producing conditions of a low temperature-resistant cellulose degradation strain/ZHENG
Guoxiang1, 2, 3, AI Shuang1, 2, YIN Ting1, 3, LI Jian1, 3(1. School of Engineering, Northeast Agricultural
③ 纤维素培养基：微晶纤维素 10 g，MgSO4 2 g， KH2PO4 2 g， NH4NO3 1 g， NaCl 0.3 g， MnSO4 2.2 g， FeSO4 · 7H2O 0.01 g， 酵 母 粉 1 g， 蒸 馏 水 1 000 mL，121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。
收稿日期：2019-01-20 基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（E2015023）；国家重点研发计划项目（2017YFD0700705）；黑龙江省博士后启动基金项目（LBH-Q13023） 作者简介：郑国香（1972-），女，教授，博士，硕士生导师，研究方向为环境微生物。E-mail: zgx720331@126.com
1.1 样品采集 试验样品：土壤采自大庆扎龙湿地和腐殖质
丰富森林地区。 1.2 试验材料
① 富集培养基：蛋白胨 5 g，滤纸 5 g，NaCl
0.5 g，酵母粉 2 g，CaCO3 2 g，蒸馏水 1 000 mL， 121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。
② 基础产酶培养基：羧甲基纤维素钠 15 g， MgSO4 2 g，KH2PO4 2 g，NH4NO3 1 g，NaCl 0.3 g， MnSO4 2.2 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，酵母粉 1 g，蒸馏 水 1 000 mL，121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。
④ PDA 培养基：取新鲜马铃薯 300 g，新鲜马 铃薯洗净去除外皮，切丁，加适量蒸馏水开水煮 30 min，滤去残渣，取浸出液冷却至室温，再加入 25 g 葡萄糖和 15 g 琼脂，蒸馏水定容至 1 000 mL， pH 自然。121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。 1.3 方法 1.3.1 菌种筛选与鉴定
ment for the Utilization of Agricultural Renewable Resources, Harbin 150030, China)
Abstract: Low temperature was key factor restricting high continuous efficiency conversion of
University, Harbin 150030, China; 2. Key Laboratory of Pig-breeding Facilities Engineering, Mini-
stry of Agriculture, Harbin 150030, China; 3. Heilongjiang Key Laboratory of Technology and Equip-
摘 要：低温是制约北方寒冷地区秸秆生物持续、高效转化的主要因素，也是影响北方寒区沼气发酵全年持
续运行的关键因素。研究以秸秆利用富集限制性培养技术，从腐殖质丰富的大庆扎龙湿地土样中筛选出 1 株产生
较高纤维素酶的耐低温降解纤维素菌株，经菌株 18S rDNA 序列及形态学分析，鉴定该菌株为奥尔森青霉属，命
第 50 卷 第 2 期
东北农业大学学报
50(2): 79~89
2019 年 2 月
Journal of Northeast Agricultural University
February 2019
网络出版时间 2019-3-9 16:51:45 [URL] http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20190309.1651.004.html
第2期
郑国香等：耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化
· 81 ·
使用真菌通用引物作 PCR 扩增[11]。扩增产物序列由
上海生工测定，结果与 NCBI 网站中标准菌种样品
序列对比匹配，利用 MEGA 软件构建菌株系统发
育树。
② 纤维素酶活（CMCase）测定方法：CMC 酶活
耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化
郑国香 1, 2, 3，艾 爽 1, 2，尹 婷 1, 3，李 健 1, 3
（ 1. 东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030；2. 农业部生猪养殖设施工程重点实验室，哈尔滨 150030； 3. 黑龙江省农业再生资源利用技术装备重点实验室，哈尔滨 150030 ）
straws, also limiting the continuous operation of biogas fermentation in cold regions of North China. A newly isolated low temperature-resistant strain was successfully isolated from humus-rich soil in Daqing Zhalong wetland region by restrictive cultures and was found to be a potential cellulase producer. The isolate was identified as Penicilliumon basis of 18S ribosomal DNA sequencing and morphological observation. The optimal conditions affecting the enzyme production of strain L-11 were obtained by response surface methodology (RSM). CMCase reached the maximum 48.809 IU·mL-1 under optimized conditions, which were bran 11.05 g · L-1, soybean flour 2.32 g · L-1, initial pH 5.23 and 2.30 g · L-1
名为 L-11。经响应曲面法优化产酶条件，获得影响奥尔森青霉菌株 L-11 产酶最优条件为麸皮 11.05 g·L-1、豆粉
2.32 g·L-1、初始 pH 5.23、卵磷脂 2.30 g·L-1，羧甲基纤维素酶活（CMCase）达 48.809 IU·mL-1。低温下菌株 L-11 具
有较强的纤维素降解能力，在沼气生产领域应用前景良好，可为高转化能力基因菌株改良及富含纤维素类废弃物
· 80 ·
东北农业大学学报
第 50 卷
lecithin, indicating a high potential cellulose-degradation capacity and its better application prospect in biogas utilization field under cold environment. It also provided important seed resources for the improvement of genetic strain with high conversion capacity and comprehensive utilization of cellulose waste.
目前报道中关于低温纤维素酶生产菌研究较 少。袁楠等筛选出一组低温纤维素降解菌系[5]。亢 宗静等研究若尔盖高原湿地低温真菌特征，发现 两株低温纤维素降解菌分别为白囊耙齿菌和烟曲 霉[6]。谢宇新等筛选出纤维素低温降解菌 D5 属于假 单胞菌属，在低温堆肥升温过程中起重要作用 。 [7] 因此，筛选产纤维素酶活性高，适应自然环境能 力强菌株，对纤维素资源降解利用意义重大[8-9]。本 研究利用限制性培养方法，在湿地土壤中筛选出耐 低温、高效解纤维素降解菌株，命名为 L-11，并以 其为研究对象，利用形态学研究方法和 18S rDNA 序 列分析确定菌株菌属，优化菌株产纤维素酶品质 及其影响酶活条件，为低温纤维素降解菌应用奠 定理论基础。
① 菌种分离筛选[10]：将土壤浸出液涂布于富集 培养基平板上，置于 15 ℃低温生化培养箱 7~10 d， 挑选出生长良好、形态明显不同菌落划线分纯， 得单菌落。分离纯化后，5 ℃低温条件下培养 13~ 15 d，选择生长良好菌落，质量分数 1%刚果红染 色液染色，洗去浮色后，根据水解圈直径挑选降 解能力强菌株。用无菌接种环取 2 环得到纯菌，接 入产酶培养液，15 ℃，120 r·min-1摇床培养箱培养 7 d 后测定纤维素酶活。同样接种量接种到纤维素 培养液，相同条件培养 7~10 d，观察菌株降解微晶 纤维素能力。综合以上结果，选择纤维素酶活力 高且微晶纤维素降解彻底菌株。取分离获得液体 培养纯菌 30 μL，点接于 PDA 平板中心处，15 ℃静 置培养 5~7 d，观察并记录不同菌落菌丝形状、颜 色、生长方式等形态和生长特征，根据不同菌属 形态描述判断菌株菌属。将分离纯菌接种至 PDA 平板上，15 ℃静置培养 5 d，扫描电镜观察其孢子 形态。采用分子生物学 18S rDNA 序列分析方法，
Key words: low temperature-resistant; cellulasபைடு நூலகம்; culture condition; response surface methodo-
logy
我国东北地区是植物木质纤维素储量最多地 区，寒冷条件使大量纤维素资源无法及时有效利 用与消耗[1]。因此，高效利用东北地区纤维素资源 成为生态环境、可再生能源等领域重要课题。微 生物降解法具有便捷、低成本、环境友好等特 性。寻找耐低温纤维素降解菌，优化其产酶环境 因子，使其秸秆转化降解性能达到最佳，可解决 东北地区秋冬寒冷气候造成纤维素资源难以利用 问 题 。 [2] 1887 年 Forster 发 现 在 微 生 物 0 ℃ 以 下 生 长，但直到 1902 年嗜冷菌概念方提出。Cousin 表 明最低生长温度在 0 ℃及以下，最适生长温度在 15 ℃，最高生长温度在 20 ℃微生物为耐低温或嗜 冷微生物[3]。随分子生物学技术及极端微生物概念 提出，耐低温微生物研究发展迅速[4]。
综合利用提供菌种资源。
关键词：耐低温；纤维素酶；培养条件；响应面优化
中图分类号：Q939.9
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2019）02-0079-11
郑国香, 艾爽, 尹婷, 等. 耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化[J]. 东北农业大学学报, 2019, 50(2): 79-89. DOI: 10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2019.2.0010 Zheng Guoxiang, Ai Shuang, Yin Ting, et al. Screen, identification and optimization of enzyme-producing conditions of a low temperature-resistant cellulose degradation strain[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2019, 50(2): 79-89. (in Chinese with English abstract) DOI: 10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2019.2.0010
Screen, identification and optimization of enzyme-producing conditions of a low temperature-resistant cellulose degradation strain/ZHENG
Guoxiang1, 2, 3, AI Shuang1, 2, YIN Ting1, 3, LI Jian1, 3(1. School of Engineering, Northeast Agricultural
③ 纤维素培养基：微晶纤维素 10 g，MgSO4 2 g， KH2PO4 2 g， NH4NO3 1 g， NaCl 0.3 g， MnSO4 2.2 g， FeSO4 · 7H2O 0.01 g， 酵 母 粉 1 g， 蒸 馏 水 1 000 mL，121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。
收稿日期：2019-01-20 基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（E2015023）；国家重点研发计划项目（2017YFD0700705）；黑龙江省博士后启动基金项目（LBH-Q13023） 作者简介：郑国香（1972-），女，教授，博士，硕士生导师，研究方向为环境微生物。E-mail: zgx720331@126.com