酶蛋白的化学修饰

残基的重要试剂。
四、巯基的化学修饰
• 5，5－二硫代－双（2－硝基苯甲酸）
（DTMB,Ellman试剂）是最常用的巯基修饰 剂，它与巯基反应形成二硫键，释放出1个 2－硝基－5－硫苯甲酸阴离子，此阴离子在 412nm有最大光吸收。该试剂是当前定量酶 分子中巯基数目的最常用试剂。它还用于研 究蛋白质的构象变化。
（1）化学修饰的时间进程分析 （2）确定必需基团的性质和数目
三、化学修饰结果的解释
• 1.蛋白质功能改变的解释
• 2.修饰残基的不稳定性
• 3.没有被发现的修饰
第三节 酶蛋白侧链的修饰
• 蛋白质侧链上的功能基主要有：
氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚基、吲哚基、胍
基、甲硫基。
• 修饰反应主要有：
酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、
• 2. 确定氨基酸残基的功能 • 3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量
二、化学修饰酶在医药和生物技术 中的应用
• 1. 酶的表面化学修饰：
可溶性大分子，如聚乙二醇（PEG)、单甲 氧聚乙二醇（MPEG)、聚丙烯酸（PAA)、聚 氨基酸、葡聚糖、环糊精、羧甲基纤维素、 肝素等可通过共价键连于酶分子表面而进行 化学修饰。
• 3. 静电效应
• 4. 位阻效应
二、酶蛋白功能基的超反应性
• 影响超反应性的因素：
1. 蛋白质功能基的pK值
2. 蛋白质功能基的亲核性
3. 静电相互作用
4. 试剂与修饰部位的立体化学适应性
5. 试剂的结合
三、影响修饰剂反应性的因素
• 1. 选择吸附
• 2.静电相互作用
• 3.位阻效应
• 4.催化因素
代乙酸， DPC对组氨酸残基有较好的专一
性，产物在240nm有最大光吸收。
六、色氨酸吲哚基的修饰
• N－溴代琥珀酰亚胺（NBS)可以修饰吲哚
基，并通过280nm光吸收的减少跟踪反应。
• 2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB)和4－硝基
苯硫氯对吲哚基修饰比较专一。
七、酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰
• 酪氨酸残基的修饰包括酚羟基的修饰和芳 香环上的取代修饰。苏氨酸和丝氨酸残基的 羟基一般都可以被修饰酚羟基的修饰剂修 饰，但是反应条件比修饰酚羟基严格些，生 成的产物也比酚羟基修饰形成的产物更稳 定。
第三章 酶蛋白的化学修饰
概 念
• 指通过化学基团的引入或去除，使（蛋
白质的）共价结构发生改变，均称为（蛋 白质的）化学修饰。
第一节 化学修饰的原理
• 影响酶蛋白化学修饰的因素：
(1) 蛋白质功能基的反应性
(2) 修饰剂的反应性
一、影响酶蛋白功能基反应性的因素
• 1. 微区的极性
• 2. 氢键效应
亲和标记
• 指亲和试剂只与作用部位的特定基团发
生作用，而不与作用部位以外的其它基团发 生作用。
二、修饰程度和修饰部位的测定
• 1. 分析方法
用光谱法追踪检测：简便，实用，但要求修饰后 的衍生物具有独特的光谱。 用间接法：蛋白质经降解和氨基酸分析后鉴定修 饰部位，测定反应条件。
• 2.化学修饰数据的分析
第五节 酶的化学交联修饰
• 交联剂是具有两个反应活性部位的双功能
基团在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或
酶与其它分子之间发生交联反应。
交联剂类型
同型双功能试剂：两端具有相同的活性反
应基团，如双亚氨酯、二硝基氟苯。 异型双功能试剂：两端与不同基团作用 可被光活化试剂：一端与酶反应，另一端 经光照后产生一个活性反应基团。
• 5.局部环境的极性
第二节 化学修饰的方法学
• 蛋白质修饰时，需选择合适的修饰
试剂和修饰条件
一、修饰反应专一性的控制
• 1. 试剂的选择 • 2.反应条件的选择 • 3.反应的专一性
（1）利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 （2）选择不同的反应pH （3）利用某些产物的不稳定性 （4）亲和标记 （5）差别标记
（1）PEG和MPEG的化学修饰
• 使用PEG(MPEG)修饰酶，由于 PEG(MPEG)既溶于水，又溶于有机溶剂（是 两相催化剂），其免疫原性低且无毒性，含 有两个羟基有利于化学修饰，用PEG(MPEG) 修饰酶后，酶的稳定性增强，免疫原性与毒 性降低，半衰期延长，在体内的停留时间延 长，从而提高疗效 。
八、甲硫氨酸甲硫基的修饰
• 虽然甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件 下，很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原 子具有亲核性，所以可用过氧化氢、过甲酸 等氧化成甲硫氨酸亚砜。用碘乙酰胺等卤化 烷基酰胺使甲硫氨酸烷基化。
第四节 酶的亲和修饰
• 亲和标记：指亲和试剂只与作用部位的特
定基团发生作用，而不与作用部位以外的同 类或其它基团发生作用。 • 特点：修饰剂与底物具有相似的结构，对 酶活性部位具有高度的亲和性，能对活性部 位的氨基酸残基进行共价标记。
芳香环取代反应等类型
一、羧基的化学修饰
• 用水溶性的碳二亚胺修饰
二、氨基的化学修饰
• 氨基的烷基化 用三硝基苯磺酸（TNBS)修饰，在420nm 和367nm有特定的光吸收。 磷酸吡哆醛（PLP)是一种非常专一的赖氨 酸修饰剂，它与赖氨酸残基反应形成希夫碱 后再用硼氢化钠还原，其衍生物在325nm有 最大的光吸收。
第六节 酶化学修饰的应用
• 酶化学修饰后，会产生各种各样的变 化：
酶的稳定性增强，但酶的活性一般有所降 低；针对特异性的反应降低了生物识别能 力，解除了免疫原性，半衰期延长；产生了 新的催化能力；提高了在有机溶剂中的溶解 度。
一、化学修饰在酶的结构与功能研 究中的应用
• 1. 研究酶的空间结构
四、巯基的化学修饰
• 有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基专一 性很强，修饰产物在250nm有最大光吸收。 • N－乙基马来酰亚胺是一种反应专一性很强 的巯基修饰剂，反应产物在300nm有最大光 吸收。 • 烷基化试剂也是一种重要的巯基修饰剂， 修饰产物稳定，易于分析。
五、组氨酸咪唑基的修饰
• 常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPC)和碘
二、氨基的化学修饰
• 在蛋白质序列分析中氨基的化学修饰最常
用的有2，4－二硝基氟苯法（DNFB，又称
sanger试剂)，丹磺酰氯（DNS)法等。
• 另外，氨基还可用乙酸酐、碘代乙酸、酮 百度文库修饰。
三、精氨酸胍基的修饰
• 具有两个临位羰基的化合物，如丁二酮、
1，2－环己二酮和苯乙二醛是修饰精氨酸