日本落叶松根际外生菌根真菌多样性

收稿日期：2017-10-20

基金项目：国家自然科学基金项目（No.31400101）；辽宁省博士启动基金项目（No.20111143）。

作者简介：王琴（1981-），女，高级工程师，主要从事森保和土壤微生物生态研究。E-mail:wqdora@ 。

root Ectomycorrhizal fungal diversity associate roots s of Larix kaempferi

WANG Qin

（Liaoning Academy of Forest Science,Shenyang 110032,China ）

Abstract：To improve the application of mycorrhizal technology in seedling and afforestation of Larix kaempferi ,ectomy-corrhizal (ECM)fungi associated with L.kaempferi roots were investigated.A total of 40root samples of L.kaempferi were collected in 2012and 2013,and 55ECM morphotypes were detected and 28ECM fungi identified based on ITS se-quence analysis.Of these ECM fungi,Cenococcum geophilum was the most dominant species,which was detected among 95%samples,occupying 34.8%root tips,Russula sp.3，Sebacina sp.2,Tomentella sp.1，Russula sp.2and Sebaci-na sp.1were common species,the other 14species were rare speces.

Key Words ：Larix kaempferi ;ectomycorrhizal fungi;diversity;molecular identification

2018年第1期

辽宁林业科技

Journal of Liaoning Forestry Science ＆Technology

日本落叶松根际外生菌根真菌多样性

王

琴

（辽宁省林业科学研究院，辽宁沈阳110032）

摘

要：为在日本落叶松育苗和造林中科学应用外生菌根技术，研究了日本落叶松的根际外生菌

根真菌群落组成。2012年和2013年共采集了40份日本落叶松根系样本，通过形态特征检测到55种外生菌根形态型，ITS 序列分析显示共28种外生菌根真菌与日本落叶松根系共生。其中，土生空团菌是日本落叶松根系外生菌根真菌群落的优势物种，在95%的土壤样本中均检测到，占根尖总数的34.8%；Russula sp.3（编号），Sebacina sp.2，Tomentella sp.1，Russula sp.2和Sebacina sp.1是常见种；其余14个分类单元是稀有种。

关键词：日本落叶松；外生菌根真菌；多样性；分子鉴定中图分类号：S718.81

文献标识码：A

文章编号：1001-1714（2018）01-0017-04

2018№1

外生菌根（Ectomycorrhizae ，ECM ）是由土壤真菌与植物根系形成的互惠共生体[1]，广泛存在于森林生态系统中，是森林生态系统的重要组成部分。菌根真菌一方面从植物根系获取生长所需的碳源，同时又帮助植物从土壤中吸收N 、P 等矿物营养和水分，改良土壤结构，促进植物生长，提高宿主抗逆性。据保守估计全球约有20000多种[2]，我国目前报道了500余种[3-4]，还有大量的外生菌根真菌有待发现[5]。

日本落叶松Larix kaempferi 原产地是日本本

州岛中部山区，属温带喜冷湿树种。我国引种日本落叶松己有100多年历史，北起黑龙江省林口县青山林场，南至江西省庐山和四川省西高山都有分布。日本落叶松以其适应性强、早期速生、成材快、用途广、材质优良的优势，正成为我国荒山绿化和营造短周期工业用材林不可替代的树种。日本落叶松作为外来物种，引入我国后与其共生的外生菌根真菌的种类一直没有全面的报道。

本项目运用形态学和分子生物学方法，系统

开展日本落叶松的外生菌根真菌多样性研究，为外生菌根真菌技术在日本落叶松的育苗和人工造林中的应用提供科学指导。

1材料与方法

1.1研究研究地点地点

研究地点设在辽宁省本溪市本溪县新农村6组日本落叶松林内（124°02′E，41°29′N）。海拔300~450m，土壤多为山地棕壤土，土层厚度25~ 40cm，坡度12°~30°，土壤pH值5.5~6.5。主要人工林树种为日本落叶松、红松等，天然林为柞树、花曲柳、核桃楸、水曲柳等。灌木层为榛子、胡枝子等。研究区内日本落叶松林龄为15~40a。1.2样品采集

在日本落叶松林，分别于2012年和2013年进行采样。在每个采样季节随机选择20株落叶松。沿主干挖取落叶松根系来研究其外生菌根真菌组成。土壤和根系样品装在自封袋内带回实验室，4℃保存。2个采样日期共采集落叶松根样40份。

1.3样品处理

土样的处理参照Agerer[6]的描述。样品在自来水中浸泡数小时后，在380µm的土样筛上清洗，去除日本落叶松根系上的土壤颗粒及植物残体。挑出直径小于2mm的根样，剪成长度约2cm的根段。在EZ4HD体式显微镜（莱卡，德国）下观察根段，并根据宏观特征将外生菌根根尖归类。宏观形态包括外生菌根的形状、颜色、大小；外生菌根分支末端形状，菌套表面特征和质地以及外延菌丝、菌索和菌核等特征。

每份样本中随机选择25个根段进行外生菌根研究，去掉老化的根尖，记录每个根段上外生菌根根尖数目和未被侵染的根尖数目。根据形态特征将外生菌根根尖归类，并记录各个形态型外生菌根根尖数目。从每个形态型中挑选新鲜的根尖（不超过3个）放到1.5mL的离心管中，－20℃保存，用于分子实验。

1.4DNA提取

DNA提取参照Gardes&Bruns[7]的方法，略有改动。

1.5PCR扩增

采用真菌通用引物ITS1F（5'-CTTGGTCAT TTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS-4（5'-TCCTCCG

CTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增反应。PCR 反应的混合液总体积为50μL，反应液包括1μL DNA模板，1×PCR缓冲液，2.0mM MgCl2，0.2mM dNTP，15pmol引物，2.5U DNA聚合酶，在100TM Programable Thermal PCR仪上进行扩增。反应条件为95℃预变性5min；94℃变性40s，50℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

1.6DNA序列分析

PCR产物进行测序，序列由华大基因组研究中心有限公司测定。

用每个测得的ITS作为靶序列，在GenBank 和UNITE数据库中搜索同源序列，挑选与形态型序列最相近的参考序列，结合系统发育分析对外生菌根真菌进行鉴定。序列相似性大于97%的认为是一个种[8]。

1.7数据分析

本实验中用重要值表示物种的优势度。重要值用相对频率和相对多度之和表示。相对频率指一个种的出现次数除以所有种的次数之和[9]。相对多度指一个种的根尖数目之和除以所有种的根尖数目之和。定义“优势种”为在>80%的样本（32份样本）中被检测到的外生菌根真菌；“常见种”为>30%的样本（12份样本）中被检测到的外生菌根真菌。

用EstimateS version8.0[10]构建物种累积曲线。2结果与分析

2.1日本落叶松的外生菌根侵染率和菌根真菌的多样性

两次样本中，检测到日本落叶松的外生菌根真菌侵染率分别为91.4%和93.1%。

从40份根样中共检测1000个根段，获得7981个菌根根尖，根据形态归类得到55个形态型。对这55个形态型进行ITS序列分析后得到28个外生菌根真菌分类单元。

以28个外生菌根的ITS为靶序列，用Blast程序在GenBank和UNITE中进行DNA碱基序列相似性搜索，结果显示23个分类单元属于担子菌（占总数的82.1%），5个分类单元属于子囊菌，分属于10科11属。其中6个鉴定到种（土生空团菌Cenococcum geophilum，美味乳菇Lactarius deliciosus，红菇Russula albidula，正红菇R.

辽宁林业科技

第1期2018年