骨源性碱性磷酸酶的测定及注意事项

骨源性碱性磷酸酶的测定及注意事项
血浆中骨源性碱性磷酸酶(BAP)活性测定，首先是血球和血浆的分离，这一过程是基于全血样品经血浆分离器将血球截留在分离器的血球容纳膜上，而血浆渗滤穿过转运膜到达反应膜的特定区域，血浆分离完成后，将血浆分离器从反应装置上取下。

第二步是BAP与血浆中其它组分，包括其它来源的碱性磷酸酶(ALP)分离达到特异测定BAP的目的。

这一目的实现是根据小儿型BAP(NBAP)和成人BAP(ABAP)分子结构中糖基类型的不同，分别选择相应的亲和素，我们可称之为NBAP-结合蛋白和ABAP-结合蛋白，预先固相在反应膜的特定区域—反应区上。

当血浆经过此区域渗滤时，BAP即被结合，而其它组成滤过或被滴加的洗涤液清洗掉，从而完成特异性亲和反应。

第三步方可进行BAP的活性测定显色反应。

反应膜固定在反应滑板上，待亲和反应完成后，将反应滑板推动，使反应膜到达反应孔正中，将显色液滴加到反应孔内的反应膜上，在37℃反应一定时间，酶促反应显色的深浅与BAP活性成正比，对照说明书上的标准色板目测判读BAP活性。

作为干化学分析技术，结果判断是对照标准板目测做出的半定量分析。

其中，标准色板的色阶印刷在说明书上，不同批次的产品使用同一标准色板，如何使每批次的产品使用同一标准色板，如何使每批产品酶促显色的深浅都能与标准色板一致呢?这是通过每批产品出厂前的校正实现的。

校正是用已知NBAP(活性为200U／L，250U／L，300U／L)和ABAP(活性为150U／L，200U／L，250U／L)的血清(17µl)进行的，在37℃进行反应，使显色强度与标准色板上相应色强相一致，确定所需的反应时间为每批产品说明书上填写的反应时间(多少分钟)。

可见，在影响酶促反应的诸多因素(底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度、PH值、反应温度、激活剂等辅助因子)一定的前提下，样品中BAP催化反应产物的多少(显色强度)只决定于反应时间的长短。

从上述校正过程可见，欲使测定结果可靠而且重复性好，需要严格掌握的操作环节，一是反应温度应控制在37℃±0．1℃范围内；二是反应时间严格按照说明书上给定的时间；三是如果不用全血分析，直接用血清作为样品分析时，应定量加人17µl 。

另外，对照说明书上的每步操作，BAP活性测定的质量控制还应包括：
第1步：在反应装置的加样孔中，均匀滴加两滴洗涤液。

待其渗入，目的在于加随后的全血样品滴加后渗滤顺利，血球和血浆分离较快，其渗入一般较快，如渗入缓慢，可用手轻压一下血浆分离器，即可迅速渗入。

如漏加洗涤液，则有可能使样品血浆分离缓慢且不均匀，将影响下一步亲和反应及显色反应，最后人为地使显色斑点均一性差。

第2步：试剂盒要求使用新鲜全血，不能使用抗凝血。

因某些抗凝剂会抑制BAP的活性。

采血时试剂盒是配套的30µl定量采血管，手持有黄线的一端，用另一端吸取血液标本恰好至黑色刻度线，然后用吸球迅速将其均匀加入加样孔中，注意勿产生气泡。

如用血清分析，则需加17／J 1。

加样后，血液一般在30秒内可全部渗入。

如渗透较慢，可用手轻压一下分离器。

第3步：待血液全部渗入后，再逐滴加入两滴洗涤液。

由于此时膜表面已截留了血球。

所以此时洗涤液渗滤较慢，一般约需1—2分钟。

如个别又出现渗入较慢的，也可用手轻压分离器，即可加快渗入速度。

第4步：待洗涤液渗入后，此时样品中血浆已完全转运到亲和膜上，将血浆分离器从反应装置上取下，即可见反应滑板上的圆形反应膜。

注意膜上不能附着有其它膜片，如有可能为分离器上的过渡膜松动脱落而成，此时应用镊子或分离器一角将其挑去。

第5步：为了除去血浆中其它物质的干扰，在反应膜上只保留BAP结合蛋白复合物，在反应膜上再滴加两滴洗涤液(小儿型)或中止液(成人型)，此时液体渗入较快。

第6步；推动反应滑板，使反应膜定位在反应孔的正中，此步骤使亲和反应和酶促显色反应在两个不同的区域进行，以避免亲和反应对显色反应的干扰，提高检测灵敏度和特异性。

第7步；在反应孔正中滴加一滴显色液，置37℃恒温水浴箱中按说明书上标明的反应时间进行保温反应。

滴加显色剂时，应先将显色剂平衡至室温。

注意：反应温度指的是水浴箱内的气温，而非水的温度；且反应装置应放在试管架或别的支架上，切勿将反应装置放在水中进行反应，放时也要注意避免反应膜上溅上水滴。

显色液正常的颜色为淡黄色，在2-8℃避光条件下可稳定一年，如变蓝或变成无色，可能是运输过程中外界因素的影响所致，对检测结果有一定影响，请勿使用并及时与供应商或公司技术服务部门联系。

第8步：显色结束后，将反应滑板推回原位，此时反应膜上剩余的显色液将会被吸收掉，之后滴加一滴中止液，停止酶促显色反应。

因为显色反应时间已经出厂前校正确定，故实际显色时间与说明书上标明的显色时间应尽可能接近。

第9步：试剂盒使用的显色系统是BCIP／INT，显色产物是一种蓝紫色色淀。

正常小儿血浆BAP活性一般≤200U／L,~E常成人血浆BAP活性一般≤150U／L，钙营养不良者血浆中BAP活性升高，随钙缺乏程度不同，反应膜上显色强度不同。

报告时，对照标准色板报告：小儿：≤200U／L，250U／L，300U／L。

如显色偏离标准色板标明的数值，则可据目测实际报告为200-250U／L,250-300U／L或>300U／L；
成人：≤150U／L，200U／L≤200U／L。

如显色偏离标准色板标明的数值，则可据目测，实际报告为150-200U／L，200-250U／L或>250U／L。