植物分子育种之细胞工程

极性与细胞分化
所谓极性（polarity），是指植物的器官、组织、甚至单个细 胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理分化上的梯 度差异。 在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。
TE的形成与细胞分化
通常把离体培养中TE(tracheary elements,管状分子) 细胞的出现作为组织分化的标志。 而极性的建立似乎又是微管发生的一个信号，极性建 立后生长素按极性方向流动，导致TE细胞分化。 由于TE细胞在分化过程中具有细胞壁加厚，原生质 体自溶等容易观察的细胞特征，从而又为植物细胞分 化研究提供了模式体系。
器官，组织培养时细胞分裂首先发生在 伤口部位
－愈伤组织的形成是脱分化的细胞重新进入活跃分裂的结果，但不是脱 分化的过程。 －有些外植体的细胞脱分化以后，直接形成胚性细胞进而形成成体细胞 胚。 －在组织器官培养时，愈伤组织内的细胞脱分化过程是不一致的。
三 培养细胞再分化
所谓细胞分化（differentiation）,是指导致细胞形成不同结 构，引起功能改变或潜在发育方式的过程。
在我国，早在20世纪30年代，李继侗等进 行银杏离体培养，获得了小植株。并发现培养 基中加入银杏胚乳提取物可促进离体胚生长。 罗宗洛等对玉米根尖培养成功。罗士韦将菟丝 子茎尖培养成功并在试管内开花。
植物细胞工程涉及部分概念
•植物组织培养(Plant tissue culture) •外植体（Explant）：用于体外培养的植物组织。在组织培养中， 我织来•无•愈器们 或 用 特伤 官把器作定组发由官离结织生活。体构(（C体在培和Oal植组养功rlug物织的能sa)n：（培那的o从母养部细ge植体中分胞ne物），组团si各上我织。s）种切们或：器取把器在官下由官组的来活。织外用体培植作植养体离物和增体（悬殖培母浮而养体培形的）养成那上中的部切由一分取培种组下养 物形成根和芽的现象
植物分子育种
植物分子育种是指把供体带有目的性状的 遗传信息分离提取出来，导入待改良植物 细胞中，使它整合、表达和遗传，并根据 人们的农业生产需要选育出带有目的性状 的优良个体，培育出具有农业经济价值的 新品种。
细胞工程：是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借
助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性， 以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科 学技术
genus
Media
同一物种不同基因型
同一基因型不同外植体
一、有机营养物（Organic co1m、p糖ounds）
*1902年Haberlandt试图离体培养绿色叶肉细胞以解决碳 源问题，但未能实现。因此离体培养必需依赖外来源。 * 常用碳源为蔗糖、果糖、葡萄糖，其中蔗糖是最常用的， 浓度为2－5％ 。 * 其它形式碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露醇、乳糖 *** 高压灭菌和过滤灭菌对碳源的影响
与物理、化学技术相结合―――植物改良
二、研究任务
通过植物细胞工程这一技术手段，在离体培 养条件下研究植物组织、器官、细胞、原生质 体经离体诱导形成的愈伤组织形态发生规律、 外界环境条件和培养基对它的作用以及由其诱 导而形成的再生植株群体的遗传稳定性和变异 性。
三、 植物细胞工程的基本理论
1、植物细胞工程的基本理论： （1）细胞是构成植物有机体的结构和生命活动的基本结 构单位。 （2）植物细胞的全能性，即植物细胞是在生理上和发育 上具有潜在全能性（totipotent）的功能单位。
愈伤组织
器官发生
胚状体（somatic embryos ）：在离体培养过程中由外植体或 愈伤组织产生与受精卵发育方式类似的胚胎结构现象
•脱分化（dedifferentiation ）：已分化的细胞在一定因素作用 下重新恢复分裂机能并改变其原来的发展方向而沿着一条新 的途径发育的过程。
•再分化（redifferentiation ）：脱分化的细胞团或组织经重新 分化而产生新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现 象。
N6(朱自清等,1975,1987) & Nitsch H (Nitsch,1969)
WS (Wolter & Skoog 1966) & LS(Lingmal & skoog 1962) ---木本植物
---禾本科植物花粉培养
30、40年代简单培养 基无机盐浓度低，杂质高， 培养效果差
胡萝卜
黑樱桃
3、植物激素的调控作用
用
植物硫化激动素(PSK)
是近年来发现的一种植物体内小分子肽类生长调节 因子,具有促进细胞增殖等多种生物活性.
（四）、 细胞脱分化与愈伤组织形成
细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化 必然会导致细胞分裂。
对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂发生在细 胞完全脱分化之后。
从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条 件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，分化也可 以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的不同 表现型。
细胞分化中基因组变化： 基因表达产物及其调控与修饰是细胞分化的本质所在，越来 越多的研究显示，细胞分化主要受基因在转录水平和转录后 水平的调控，其中一些特异性蛋白质基因的表达调控在细胞 分化过程中起到了重要作用。
二、细胞脱分化
培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无 分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分 化 离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分 裂之前。 静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重 要标志。
（一）细胞脱分化过程可分为3个阶段：
(二) 细胞生理与结构变化
（三）、 细胞脱分化的调控机理
* 1958年，在美国Steward（施图尔德,英国）等 从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中诱导产生了胚 状体，形成了完整的植株。首次证实了植物细 胞全能性理论。
进入60年代，植物组织培养技术进入飞速发展 阶段，并应用于生产。
* 1960年， Morel（莫雷尔）培养兰花茎尖成功， 实现了快速繁殖和去病毒的目的。该方法繁殖 系数极高。
研究显示，植物激素对细胞生长与分化的调 控是一个复杂的级联调控过程，离体培养条件下， 由于外植体细胞所处的生理状态不同以及内源激 素水平的差异，试图寻找外源激素水平在分化中 作用的共同模式可能是很难的。
第三节 培养基的基本成分和主要培 养基
培养基是植物组织培养成功的关键和保证。 培养基是培养成功的关键，并因物种、同一物 种不同型、同一基因型不同外植体的要求不同而 有差异。
维生素
氨基酸
生长调节 物质
调节无机盐浓 度
MSM 基培S养基基本培养
（含有较高浓度 的硝酸盐、铵盐、 钾盐）
改良MS培 养基
增加各种无机盐 浓度，尤其是N和 K的浓度
椰乳、水解 酪蛋白、氨基 酸等
糖的作用
* 在胡萝卜的细胞培养中，高浓度蔗糖下形成的胚状体较少， 但其发育更接近于合子胚的情况。 *在由烟草开花植株茎形成的愈伤组织及猪耳草茎、叶组织 的再生中，葡萄糖促进花芽形成。 *在某些试验中发现，在同一激素比例下，随糖浓度的不同， 器官形成的类型也可能不同。
2、氮
含氮物质------维生素类物质和肌醇等 维生素类物质： 硫胺素---维生素B1 吡哆素---维生素B6 烟 酸---维生素B3 泛酸钙---维生素B5 肌 醇；水解酪蛋白（CH）；椰乳 （CM）；玉米乳；麦芽提取液（ME） 番茄汁（TJ）；酵母提取液（YE）
根据细胞类型不同从强到弱：
营养生长中心 ＞ 形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化细胞） ＞特化细胞（筛管、导管细胞）
根据细胞所处的组织不同从强到弱：
顶端分生组织＞居间分生组织＞侧生分生组织＞薄壁组织（基 本组织） ＞厚角组织＞输导组织＞厚壁组织
细胞全能性
脱分化
细胞分裂
再分化
个体再生
细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多 数情况下，脱分化是细胞全能性的前题，再分化是细胞全能性 表达的最终体现。
培养基的发展过程
1865年 Knop 盐溶液培养基
1939年 Gautheret 愈伤组织培养基
1925年Uspeaski 和Uspenskaia海 藻培养基
1943年 White 根培养 基
改良培养基
1962年 Mnjrashige & Skoog MS培养基
B5--十字花科
(Gamborg 等， 1968)
* 1934年， White（怀特，美国）培养番茄根尖 建立了无性繁殖系，获得了离体根培养的真正 成功。1937年，他又发现了B族维生素对离体 根生长的重要作用。1939年，怀特成功培养了 烟草原形成层细胞。怀特研制出了White培养 基。
* 1934年， Gautheret（高斯雷特，法国）培养 山毛榉、黑杨的形成层组织，发现了生长素 IAA的促进作用。1939年，他培养胡萝卜根形 成层也获得成功。
小麦胚组织培养示意图
2、植物细胞工程所涉及到的主要技术和应用
技术
应用
植物组织与细胞培养技术―作物品种改良
ຫໍສະໝຸດ Baidu
植物细胞大批量培养技术―名贵药物、生物药品
植物细胞融合技术―――――创造新植物种
植物染色体工程技术――――创造作物新类型
DNA重组技术――――――― 植物改良
外源基因导入技术――――――植物改良
•体细胞无性系变异（Somaclone and Somaclonal variation ）
第二节 植物细胞全能性以 及分化和去分化
一、细胞全能性概述
一个细胞所具有的生产完整生物个体的固有能力称之为细胞 的全能性。 细胞全能性的相对性 不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养 反应； 即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞 均可以直接产生植物个体； 动植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。
细胞周期对脱分化的调控 PSK的发现及其对细胞脱分化的影响 激素诱导表达基因与细胞脱分化 细胞脱分化与染色体解凝聚
1 细胞周期对植物细胞脱分化的调控
2、
CycD基因首先表达生成CycD,在相关调节因子的帮助下 CycD复合体使CDKa活化，进而对Rb(G1期限制点调控分子) 磷酸化，使细胞通过“限制点”进入分裂周期后，则CDKb 与CycB以及相关的调节蛋白质完成从S期到M期的调控。
2、 植物细胞工程发展过程
* 1838年，M．J．Schleiden提出细胞学说， 1839年T．Schwann认为细胞学说也适用于 动物。即细胞是生物有机体结构与功能的及 基本单位。
* 1902年，德国植物学家G．Haberlandt提出 了“细胞全能性”理论。他本人被誉为“植 物组织培养之父”。
激素对细胞分化的调控作用
激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因 素。
生长素和细胞分裂素、GA3、 ABA 、乙烯
如：
细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的 协调作用，他们的量与比值的不同配合，对于细胞分化起 着重要调节作用。
先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分 裂而不利于细胞分化。反之，则有利于细胞分化。如果两 者同时处理，则可促使分化频率的提高。
基因工程：目的基因的定位、分离、重组、表达等。
分子标记辅助育种：DNA分子遗传标记，或DNA标记。
第一节 植物细胞工程概述
一、植物细胞工程概念(Definition of plant cell engineering)：
1、植物细胞工程是植物生物技术的一个重要组 成部分，是在离体培养条件下，细胞水平上对植 物材料进行遗传操作的技术，即对植物体的任何 一个部分（器官、组织、细胞、原生质体）进行 离体诱导使其称为完整植株的技术。
* 1937～1938年， Nobecourt（诺必考特,法国） 培养胡萝卜根和马铃薯块茎的薄壁组织成功。
在 这 个 阶 段 ， 由 于 White 、 Gautheret 和 Nobecourt 等 人 的 出 色 工 作 ， 建 立 了 植 物 组 培 的综合培养基。三人一起被誉为植物组织培养的 奠基人。1943年，White重新提出了植物细胞 全能性学说，并著了《植物组织培养手册》一书。
植物细胞按照分裂能力分为三类：
第一类是始终保持分裂能力，如茎尖、根尖及形成层细胞； 第二类是永久失去分裂能力的终端分化细胞。如筛管、导管、 气孔保卫细胞等特化细胞； 第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可以重 新启动分裂的G0细胞，如表皮细胞及各种薄壁细胞。
一个植物细胞向分生状态恢复过程所能进行的程度，取 决于它在自然部位上所处位置和生理状态。