儿童型脊肌萎缩症基因诊断的研究解读

儿童型脊肌萎缩症基因诊断的研究
唐北沙谭斯品杨期明严新翔
【摘要】目的探讨儿童型脊肌萎缩症(CSMA)的基因诊断方法。

方法
应用PCR-酶切分析法对7例CSMA患儿进行运动神经元生存(SMN)基因的基因诊断分析。

结果7例CSMA患儿SMN基因7号、8号外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切后,6例仅剩下165 bp与125 bp片段，表现有SMN基因7号、8号外显子缺失；1例仅剩下165 bp片段，表现有SMN基因7号外显子缺失。

结论PCR-酶切检测SMN基因7号、8号外显子缺失可作为儿童型脊肌萎缩症的可靠
的基因诊断方法。

【关键词】儿童型脊肌萎缩症运动神经元生存基因PCR-酶切
A study on gene diagnosis in childhood-onset spinal muscular atrophy
Tang Beisha,Tan Sipin,Yang Qiming
Department of Neurology, Xiang Ya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】Objective To investigate the gene diagnosis of childhood-onset spinal muscular atrophy(CSMA). Methods PCR-enzyme digestion was used to perform the survival motor neuron (SMN) genetic diagnosis of 7 patients with CSMA.Results PCR produ-cts of the SMN gene exon 7 and exon 8 in 7 patients with CSMA were digested by DraI，DdeI enzyme,in which 6 patients left only 165 bp and 125
bp,they all showed the deletion of SMN gene exon 7 and exon 8;another patient left only 165 bp that showed the deletion of SMN gene exon 7.Conclusion The deletion of SMN gene exon 7 and exon 8 examined by PCR-enzyme digestion could be recommended as an accurate gene diagnostic method for CSMA.
【Key words】Childhood-onset spinal muscular atrophy SMN gene PCR-enzyme digestion
儿童型脊肌萎缩症（CSMA）是一种较常见的累及神经系统的常染色体隐性遗传性疾病，其发病率为1/6000～1/10000。

根据发病年龄和病程分为3个亚
型［1］，均定位在5q13.3区域，具有基因同源性［2,3］。

该病有两个疾病相关基因被克隆，一个是运动神经元生存基因（SMN）［4］，另一个是神经细胞凋亡抑制蛋白（NAIP）［5］。

经突变分析证实，93%的CSMA病人为SMN基因7号、8号外显子联合缺失［4,6］，而NAIP可能与疾病的严重程度有关［7］。

我们应用PCR-酶切技术对7例CSMA患儿进行了SMN基因诊断分析。

1 对象与方法
1.1 对象7例CSMA患儿由湖南医科大学附属湘雅医院神经内科门诊提供。

男4例，女3例，起病年龄6～35个月，平均28个月。

按照Munsat［1］ SMA 诊断标准，Ⅰ型1例,Ⅱ型2例，Ⅲ型4例。

临床表现为学龄前肌张力明显降低和自主运动的丧失。

肌肉活检示肌纤维明显萎缩，肌电图示脊髓前角细胞受损。

其父母表型正常。

1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取取外周血10 ml(肝素抗凝)，采用酚-氯仿法提取。

1.2.2 PCR引物及反应条件外显子7与8 PCR扩增的引物序列依照相应文献合成［8］。

SMN基因与其同源拷贝BCD 541cen基因7号外显子存在碱基C-T （CDNA第840位碱基）差异，8号外显子存在碱基G-A（CDNA第1155位碱基）差异，可分别在BCD 541cen PCR产物中形成DraI、DdeI的酶切位点。

酶切后PCR产物与初级PCR产物同时电泳，经染色显色后判定结果。

1.2.3 PCR反应体系40 μl：dNTPs(2 mM) 4 μl,10×PCR buffer 4 μl, Mg2+(25 mM) 2.4 μl ,上下游引物（100 ng/μl）各1 μl，模板（150
ng/μl）1 μl，Taq酶（4 U/μl）0.4 μl，外显子7加入PCR水26.2 μl。

外显子8加入PCR水25.2 μl。

外显子7 PCR反应条件(Perking-Elmer480型PCR仪)95℃预变性3分钟，95℃变性40秒，59℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共32个循环。

外显子8 PCR反应条件（Perking-Elmer 480型PCR仪）95℃预变性10分钟，72℃3分钟，72℃时加入稀释成1.5 U/μl的Taq酶1 μl,95℃变性40秒,55℃退火40秒,72℃延伸1分钟,共30个循环。

Taq酶及相应的配套buffer,dNTPs均购自Sangon公司。

电泳PCR产物用6%聚丙烯酰胺胶电泳，电压80 V，时间1小时，0.5溴化乙啶（EB）染色后，紫外灯下观察结果、照相。

2 结果
PCR产物经聚丙烯酰胺检测，7号外显子PCR产物长191 bp,8号外显子PCR产物长188 bp。

7号外显子PCR产物经DraI酶切，正常个体酶切后可出现191 bp与165 bp两个条带，8号外显子PCR产物经DdeI酶切后出现188 bp与125 bp两个条带。

患儿7号外显子PCR产物经DraI酶切仅剩下165 bp条带，8号外显子PCR产物经DdeI酶切后剩下125 bp条带。

6例CSMA患儿7号、8号外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切仅剩下165 bp与125 bp条带，故CSMA 患儿有SMN基因7号、8号外显子缺失。

1例CSMA患儿7号外显子PCR产物经DraI酶切后仅剩下165 bp条带，显示患儿有SMN基因7号外显子缺失，而未见8号外显子缺失。

3 讨论
CSMA是一种较常见的常染色体隐性遗传性疾病，国外报道该遗传病的婴儿发病率为1/6000至1/10000不等，携带有该基因的频率为1/80。

建立该种遗传病的基因诊断方法，对于防止带有该种遗传病的患儿出生、提高人口素质有
着极其重要的意义。

1995年初Lefebvre等［4］及Roy等［5］两个实验室分
别克隆分离出2个SMA疾病相关基因，各命名为SMN和NAIP，均位于5q13.3。

据国内外文献报道［4、6］，93%的CSMA患儿基因诊断结果表现为SMN基因7号、8号外显子联合缺失，5.7%表现为SMN基因7号外显子缺失，另外1.3%虽未发现该基因7号、8号外显子缺失，但在第6、7号内含子的编码区存在点突变等现象。

中国台北研究发现SMN基因7号、8号外显子联合缺失达100%［9］。

本研究中的7例CSMA患儿经PCR-酶切，基因诊断结果与上述文献报道的结果基本相符，说明CSMA患儿的SMN基因缺失频率较高,SMN基因7号、8号外显子联合缺失是CSMA患儿基因缺失的最常见类型。

因此，SMN基因缺失的PCR-酶切检测可作为CSMA患儿的可靠的基因诊断手段,对CSMA家系的遗传咨询及产前诊断具有重要意义。

作者单位：唐北沙（410008湖南医科大学湘雅医院神经内科）
谭斯品（410008湖南医科大学湘雅医院神经内科）
杨期明（410008湖南医科大学湘雅医院神经内科）
严新翔（410008湖南医科大学湘雅医院神经内科）
参考文献
1.Munsat TL,Davies KE. International SMA consortium meeting. Neuromuscular Disord, 1992,2:423
2.Brzustowicz LM, Lehner T, Castilla LH, et al. Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular to 5q11.2～1
3.3. Nature, 1990,344:540
3.Gilliam TC, Brzustowicz LM, Castilla LH, et al. Genetic homogeneity between acute and chronic forms of spinal muscular atrophy. Nature, 1990,345:823
4.Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell, 1995,80:155
5.Roy N, Mahadevan MS, Mclean M,et al.The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is a partially deleted in individual with spinal muscular atrophy. Cell, 1995, 80:167
6.Rodrignes NR, Owen N, Talbot K, et al. Gene deletions in spinal muscular atrophy. J Med Genet, 1996, 33:93
7.Burle P,Burglen L,Clermont O,et rge scale deletions of the
5q13 region are specific to Werding-Hoffmann disease.J Med
Genet,1996,33:281
8.Gerit Van der Steege.PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy. Lancet, 1996,345:985
9.Chang JG, Jong YJ, Huang JM, et al. Molecular basis of spinal muscular atrophy in Chinese. Am J Hum Genet,1995, 57:1503。