儿童型脊肌萎缩症基因诊断的研究解读
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儿童型脊肌萎缩症基因诊断的研究
唐北沙谭斯品杨期明严新翔
【摘要】目的探讨儿童型脊肌萎缩症(CSMA)的基因诊断方法。
方法
应用PCR-酶切分析法对7例CSMA患儿进行运动神经元生存(SMN)基因的基因诊断分析。
结果7例CSMA患儿SMN基因7号、8号外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切后,6例仅剩下165 bp与125 bp片段,表现有SMN基因7号、8号外显子缺失;1例仅剩下165 bp片段,表现有SMN基因7号外显子缺失。
结论PCR-酶切检测SMN基因7号、8号外显子缺失可作为儿童型脊肌萎缩症的可靠
的基因诊断方法。
【关键词】儿童型脊肌萎缩症运动神经元生存基因PCR-酶切
A study on gene diagnosis in childhood-onset spinal muscular atrophy
Tang Beisha,Tan Sipin,Yang Qiming
Department of Neurology, Xiang Ya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】Objective To investigate the gene diagnosis of childhood-onset spinal muscular atrophy(CSMA). Methods PCR-enzyme digestion was used to perform the survival motor neuron (SMN) genetic diagnosis of 7 patients with CSMA.Results PCR produ-cts of the SMN gene exon 7 and exon 8 in 7 patients with CSMA were digested by DraI,DdeI enzyme,in which 6 patients left only 165 bp and 125
bp,they all showed the deletion of SMN gene exon 7 and exon 8;another patient left only 165 bp that showed the deletion of SMN gene exon 7.Conclusion The deletion of SMN gene exon 7 and exon 8 examined by PCR-enzyme digestion could be recommended as an accurate gene diagnostic method for CSMA.
【Key words】Childhood-onset spinal muscular atrophy SMN gene PCR-enzyme digestion
儿童型脊肌萎缩症(CSMA)是一种较常见的累及神经系统的常染色体隐性遗传性疾病,其发病率为1/6000~1/10000。
根据发病年龄和病程分为3个亚
型[1],均定位在5q13.3区域,具有基因同源性[2,3]。
该病有两个疾病相关基因被克隆,一个是运动神经元生存基因(SMN)[4],另一个是神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)[5]。
经突变分析证实,93%的CSMA病人为SMN基因7号、8号外显子联合缺失[4,6],而NAIP可能与疾病的严重程度有关[7]。
我们应用PCR-酶切技术对7例CSMA患儿进行了SMN基因诊断分析。
1 对象与方法
1.1 对象7例CSMA患儿由湖南医科大学附属湘雅医院神经内科门诊提供。
男4例,女3例,起病年龄6~35个月,平均28个月。
按照Munsat[1] SMA 诊断标准,Ⅰ型1例,Ⅱ型2例,Ⅲ型4例。
临床表现为学龄前肌张力明显降低和自主运动的丧失。
肌肉活检示肌纤维明显萎缩,肌电图示脊髓前角细胞受损。
其父母表型正常。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取取外周血10 ml(肝素抗凝),采用酚-氯仿法提取。
1.2.2 PCR引物及反应条件外显子7与8 PCR扩增的引物序列依照相应文献合成[8]。
SMN基因与其同源拷贝BCD 541cen基因7号外显子存在碱基C-T (CDNA第840位碱基)差异,8号外显子存在碱基G-A(CDNA第1155位碱基)差异,可分别在BCD 541cen PCR产物中形成DraI、DdeI的酶切位点。
酶切后PCR产物与初级PCR产物同时电泳,经染色显色后判定结果。
1.2.3 PCR反应体系40 μl:dNTPs(2 mM) 4 μl,10×PCR buffer 4 μl, Mg2+(25 mM) 2.4 μl ,上下游引物(100 ng/μl)各1 μl,模板(150
ng/μl)1 μl,Taq酶(4 U/μl)0.4 μl,外显子7加入PCR水26.2 μl。
外显子8加入PCR水25.2 μl。
外显子7 PCR反应条件(Perking-Elmer480型PCR仪)95℃预变性3分钟,95℃变性40秒,59℃退火40秒,72℃延伸1分钟,共32个循环。
外显子8 PCR反应条件(Perking-Elmer 480型PCR仪)95℃预变性10分钟,72℃3分钟,72℃时加入稀释成1.5 U/μl的Taq酶1 μl,95℃变性40秒,55℃退火40秒,72℃延伸1分钟,共30个循环。
Taq酶及相应的配套buffer,dNTPs均购自Sangon公司。
电泳PCR产物用6%聚丙烯酰胺胶电泳,电压80 V,时间1小时,0.5溴化乙啶(EB)染色后,紫外灯下观察结果、照相。
2 结果
PCR产物经聚丙烯酰胺检测,7号外显子PCR产物长191 bp,8号外显子PCR产物长188 bp。
7号外显子PCR产物经DraI酶切,正常个体酶切后可出现191 bp与165 bp两个条带,8号外显子PCR产物经DdeI酶切后出现188 bp与125 bp两个条带。
患儿7号外显子PCR产物经DraI酶切仅剩下165 bp条带,8号外显子PCR产物经DdeI酶切后剩下125 bp条带。
6例CSMA患儿7号、8号外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切仅剩下165 bp与125 bp条带,故CSMA 患儿有SMN基因7号、8号外显子缺失。
1例CSMA患儿7号外显子PCR产物经DraI酶切后仅剩下165 bp条带,显示患儿有SMN基因7号外显子缺失,而未见8号外显子缺失。
3 讨论
CSMA是一种较常见的常染色体隐性遗传性疾病,国外报道该遗传病的婴儿发病率为1/6000至1/10000不等,携带有该基因的频率为1/80。
建立该种遗传病的基因诊断方法,对于防止带有该种遗传病的患儿出生、提高人口素质有
着极其重要的意义。
1995年初Lefebvre等[4]及Roy等[5]两个实验室分
别克隆分离出2个SMA疾病相关基因,各命名为SMN和NAIP,均位于5q13.3。
据国内外文献报道[4、6],93%的CSMA患儿基因诊断结果表现为SMN基因7号、8号外显子联合缺失,5.7%表现为SMN基因7号外显子缺失,另外1.3%虽未发现该基因7号、8号外显子缺失,但在第6、7号内含子的编码区存在点突变等现象。
中国台北研究发现SMN基因7号、8号外显子联合缺失达100%[9]。
本研究中的7例CSMA患儿经PCR-酶切,基因诊断结果与上述文献报道的结果基本相符,说明CSMA患儿的SMN基因缺失频率较高,SMN基因7号、8号外显子联合缺失是CSMA患儿基因缺失的最常见类型。
因此,SMN基因缺失的PCR-酶切检测可作为CSMA患儿的可靠的基因诊断手段,对CSMA家系的遗传咨询及产前诊断具有重要意义。
作者单位:唐北沙(410008湖南医科大学湘雅医院神经内科)
谭斯品(410008湖南医科大学湘雅医院神经内科)
杨期明(410008湖南医科大学湘雅医院神经内科)
严新翔(410008湖南医科大学湘雅医院神经内科)
参考文献
1.Munsat TL,Davies KE. International SMA consortium meeting. Neuromuscular Disord, 1992,2:423
2.Brzustowicz LM, Lehner T, Castilla LH, et al. Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular to 5q11.2~1
3.3. Nature, 1990,344:540
3.Gilliam TC, Brzustowicz LM, Castilla LH, et al. Genetic homogeneity between acute and chronic forms of spinal muscular atrophy. Nature, 1990,345:823
4.Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell, 1995,80:155
5.Roy N, Mahadevan MS, Mclean M,et al.The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is a partially deleted in individual with spinal muscular atrophy. Cell, 1995, 80:167
6.Rodrignes NR, Owen N, Talbot K, et al. Gene deletions in spinal muscular atrophy. J Med Genet, 1996, 33:93
7.Burle P,Burglen L,Clermont O,et rge scale deletions of the
5q13 region are specific to Werding-Hoffmann disease.J Med
Genet,1996,33:281
8.Gerit Van der Steege.PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy. Lancet, 1996,345:985
9.Chang JG, Jong YJ, Huang JM, et al. Molecular basis of spinal muscular atrophy in Chinese. Am J Hum Genet,1995, 57:1503。