第二章 色谱分析理论基础

• 死体积(VM): VM t M F0
• 保留体积(VR): VR t R F0
' F0 (t R t M ) F0 • 调整保留体积(V’R): VR' t R
• 相对保留值(ri,s或a):
ri , s
' ' t Ri VRi ' ' t Rs VRs
• 标准偏差σ
0.607倍峰高处的峰宽的一半
• 半峰宽Y1/2
峰高一半处的峰宽：Y1/2=2.354σ
• 峰底宽度Y
色谱峰两侧转折点切线在基线上的截距： Y=4σ
关于保留值的术语
• 死时间(tM): 无保留组分出峰时间
• 保留时间(tR):流出色谱柱的组分浓度最 高的时间
' tR tM • 调整保留时间(t’R): t R
4. 每个塔板上的分配系数相同；
色谱峰的产生 • 设色谱柱有5个塔板，分配系数为1，
mM 0.5 进样 mS 0.5
mM 0.25 进气 1V mS 0.25
0.25 0.25
mM 0.125 进气 2V mS 0.125
0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125
• 1901《一种新型吸附现象及其在生化分析上 的应用》 • 1906 年发表的文章中，首次提出了色谱的 概念。
• 利用混合物中不同组 分在两相之间进行不 同分配的原理，使混 合物分离，并进行定 性和定量分析的方法。
• 色谱法是一种分离方法。
• 它的特点是：有两相，一是固定 相，一是流动相，两相作相向运 动。
• 没有考虑纵向扩散，分配系数的变 化，达到平衡所需的时间。
（2）速率理论
• 速率理论是1956年荷兰学者Van Deemter等提出，因此又称作范第姆 特方程。
• 运用流体分子规律研究色谱过程中产 生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔 板高度与流动相线速度的关系，揭示 了影响塔板高度的动力学因素。
气相色谱速率方程
• 保留指数 (I) ：规定正构烷烃的保留指数 是其碳数的 100 倍，其它物质的保留指 数在实际色谱条件下测定。选取保留值 与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系， 其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测 物的保留指数由下式计算：
' ' lg t R lg t Rz I 100( ' Z) ' lg t R( z 1) lg t Rz
A. J. P. Martin 1910～2002
R. L. M. Synge 1914～1994
2、色谱法分离原理
• 当流动相中所携带的混合物流过固定相时，
会和固定相发生作用。由于混合物中各组 分在性质和结构的差异，与固定相之间作 用力的大小也有差异。因此在同一推动力 作用下，不同组分在固定相中的滞留时间 有长有短，从而按先后不同的次序从固定 相中流出。
• 纸色谱（Paper Chromatography）
用滤纸做固定相或固定相载体的色谱
• 薄层色谱（Thin Lay Chromatography）
固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上
按分离过程作用原理可分为
• 吸附色谱
• 分配色谱
• 离子交换色谱
• 排阻色谱
4. 色谱相关术语
色谱仪的一般组成
载流系统 进样器
塔板理论的贡献
• 塔板理论有助于我们形象的理解色谱 的分离过程。
• 导出色谱流出曲线方程，它符合高斯 分布，与实验现象相吻合。 • 导出理论塔板数的计算公式，作为柱 效的评价指标。
塔板理论的局限 • 塔板高度 H 是一个抽象的物理量， 它的色谱本质是什么？它与哪些参 变量有关，又怎样影响峰的扩张？ 对实验的指导意义有限。 • 不能解释流速对理论塔板数的影响。
其中：C0-初始浓度 tR-保留时间
对色谱流出曲线方程的讨论
C C0 e 2
( t t R )2 2 2
• 当 t=t R 时， C=C max ，峰高正比于进样量 C 0 ， 是峰高定量的理论基础。 • 当 n 越大， C max /C 0 越大。即保留时间一定时， 塔板数越多，峰越高。 • Cmax反比于tR，tR小，Cmax大， 保留时间小的 组分峰高且窄；tR大，Cmax小， 保留时间大 的组分峰低且宽。
• 速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响 塔板数n的因素，即影响塔板高度H的因素。
• 速率方程的一般形式：H=A+B/u+Cu
• A-涡流扩散项
• B-分子扩散项
• C-传质阻力项
• u-流速
涡流扩散项A
• 由不等路径造成的色谱峰扩展。
• 由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围 不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短 不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形 成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄 且直的路径运行，以较快的速度通过色谱 柱，发生分子超前，反之，有些分子发生 滞后，从而使色谱峰产生扩散。
液相色谱法
• 以液体为流动相的色谱法（Liquid Chromatogaphy）
• 按固定相状态的不同可分为： • 液固色谱(LSC) • 液液色谱(LLC) • 适合分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。
按固定相使用的形式可分为
• 柱色谱（Column Chromatography）
将固定相装在色谱柱内
-1
载气线速度（流速）的影响
• 最佳流速：u=(B/C)1/2
• 最小塔板高度：Hmin=A+2(BC)1/2 • 实用最佳流速：比最佳流速更快 • A与流速无关 • 当流速小时，B/u对H的大小起主导作用 • 当流速大时，Cu对H的大小起主导作用
mM 0.0625 0.0625 0.125 0.125 0.0625 0.0625 进气 3V mS 0.0625 0.125 0.0625 0.0625 0.125 0.0625
对流出曲线进行拟合，通过概率理论得 到流出曲线方程：
-标准偏差
C
C0 e 2π σ (t t R )2 2σ 2
t R L / uS tM L / u
tR tM t k tM tM
' R
二、色谱分析法基本理论
• 研究理论的目的
解决色谱峰的分离问题
• 三个色谱基本理论问题
• 色谱热力学问题——发展高选择性色谱柱 • 色谱动力学问题——发展高效能色谱柱 • 分离条件的最优化问题——分离条件优化
3、色谱法的分类
• 按流动相状态的不同，可分为
• 气相色谱法 (GC) • 液相色谱法 (LC)
• 超临界流体色谱 (SFC)
气相色谱法
• 以气体为流动相的色谱法（Gas Chromatogaphy）
• 按固定相状态的不同可分为： • 气固色谱(GSC) • 气液色谱(GLC) • 适合分离分析易汽化，稳定、不易分解、不易 反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构 体的分离。
• 相比β
色谱柱内固定相和流动相体积之比
CS m S / VS VM 柱内孔隙 K k k C M m M / VM VS 固定相体积
VM K VS k
相比是柱型及结构的重要特征。
• 滞留因子RS
色谱柱中样品流速与流动相流速之比
uS RS u
uS mM 1 1 RS u mS mM 1 mS mM 1 k
• 为操作条件的选择提供理论指导 • 为色谱柱的填充提供理论指导
对柱型研究和发展的影响
• 消除涡流扩散项A=0?
• Golay1957年提出毛细管柱（opentube） 的概念 • 毛细管柱A=0，H=B/u+Cu • H↓，N↑，分离能力大大提高
对柱型研究和发展的影响
• 消除分子扩散项B=0?
1、色谱动力学理论
研究流出曲线展宽的本质及曲线形状
变化的影响因素 • 塔板理论
• 速率理论
（1）塔板理论
基本假设
1. 色谱柱可分为许多完全相同的小段，每一段中 达到分配平衡所需的时间可忽略，每一段的长 度称为塔板高度H； 2. 流动相进入色谱柱时为脉冲式而不是连续式， 每次进一个板体积的流动相； 3. 待测样品开始时位于第0号塔板上，并且不会 沿色谱柱方向扩散；
2 0.01k 2 d p Cg wk.baidu.com (1 k ) Dg
容量因子
液相传质阻力项Clu
• 试样组分从固定相表面移动到固定相内部 的过程中，由于质量交换过程需要一定时 间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。 在此过程中，部分组分分子先离开固定相 表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。
d2 2 k f Cl 3 (1 k )2 Dl
A 2d p
涡流扩散项 均匀性 因子 粒径
分子扩散项B/u
• 由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。
• 由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以 塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间 中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此 使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱 峰扩展。
弯曲 因子
B 2Dg
扩散 系数
传质阻力项Cu
平 衡 浓 度
实 际 浓 度 流 动 相
分 界 面 固 定 相
传 质 阻 力 引 起 非 平 衡 过 程 示 意 图
由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成
气相传质阻力项Cgu
• 试样组分从气相移动到固定相表面的过 程中，由于质量交换过程需要一定时间 （即传质阻力）而使分子有滞留倾向。 在此过程中，部分组分分子随流动相向 前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩 展。
• 将色谱法用于分析中，则称为色谱 分析。 • 色谱分析是一种分离、分析法。
色谱的发展
• 液固色谱
• Tiselius和Claesson，瑞 典科学家，改进色谱 方法，1948年诺贝尔 化学奖
A.W. K.Tiselius 1902—1971
• 分配色谱 • Martin和Synge，英国科 学家，提出分配法， 1952年诺贝尔化学奖 • 气相色谱 • Martin和James，1951年 通过实验证明气液色谱 可行性。
液膜厚度
液相扩 散系数
气相色谱中的速率方程
H A B / u Cu 2 d p 2Dg
2 0.01k 2 d 2 d 2 k p f u 2 2 u (1 k ) Dg 3 (1 k ) Dl
速率方程的意义
• 为柱型的研究和发展提供理论依据
流体存储，净化，流速控制 进样速度，杂质过滤 分离，控温 信号转换，测定 数据记录，分析，输出
色谱仪
色谱柱
检测系统
记录系统
关于色谱图的术语
峰 标准偏差σ
峰高
峰面积
半峰宽Y1/2
峰宽Y
基线
• 基线
无组分时色谱流动相所产生的信号随时间 变化的曲线（直线）
• 基线漂移
基线定向的缓慢变化
• 基线噪声
基线随机的起伏
• 溶质在液体中的扩散系数DL≈10-5cm2/s • 溶质在气体中的扩散系数Dg≈10-1cm2/s • DL << Dg • 当采用液体作流动相时 B→0 (u > 0.5 cm/s)
• 液体作流动相时可用更细的固定相，A ↓
• HPLC柱效比GC要高2~3个数量级
操作条件对柱效的影响
u/cm.s H-u 曲线
柱效
由流出曲线方程导出：
n 5.54( tR 2 t ) 16( R )2 Y1 / 2 Y
H L/ n
n有 效
t 'R 2 t 'R 2 5.54( ) 16( ) Y1 / 2 Y
H 有 效 L / n有 效
n，H，n有效，H有效，——柱效指标
• t 一定时， Y ， Y1/2 与 n 成反比， n 越大， 峰越窄，分离效果越好； • n越大，H越小，表明组分在柱中达到 的分配平衡次数越多，对分离越有利， 但还不能预言各组分有被分离的可能 性； 相同的色谱柱对不同物质的柱效不同！！
关于分配平衡的术语
• 分配系数K (distribution coefficient )
K 组 分 在 固 定 相 中 的 浓 度 CS （一定温度） 组 分 在 流 动 相 中 的 浓 度 CM
• 分配比k（容量因子、容量比），是指在一 定温度和压力下，平衡状态时组分在固定 相中的量与在流动相中的质量的比值。是 衡量柱子对组分保留能力的重要参数。
第二章 色谱分析法
Chromatography
一、色谱分离理论基础
问题
问题1：什么是色谱法？ 问题2：为什么色谱法能将混合物分开？
问题3：色谱法的分类？
问题4：各种色谱法的应用范围？
1、色谱法概述
茨维特的实验
茨维特(M.S.Tswett)： 俄国植物学家，主要 从事植物色素的研究 工作——色谱之父