一人类外周血染色体标本制备一
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6、预固定(pre-fixation 低渗后,加新配的固定剂(甲醇︰冰醋酸= 3︰1 )1毫升,打 匀。
7 1000rpm离心10分钟,弃上清液,留沉淀。
8、固定 (fixation)
加入固定液(甲醇︰冰醋酸 = 3︰1)5ml,将沉淀打匀,固定20 分钟。
9、再离心 1000rpm离心10分钟,弃上清液,留沉淀。
20%
4% 100单位/毫升 100单位/毫升
用 3.5%NaHCO3 调 pH 到 7.0-7.2 ,玻璃滤器抽滤灭菌。在超净工 作台,分装到培养瓶中(每瓶含培养基5毫升)。培养基置于-20℃ 冰箱保存。使用前从冰箱中取出,温育至37℃。
2、肝素(heparin ):浓度0.2 %,200 毫克肝素粉末溶于
4、离心 (centrifugalization )
以1000rpm离心10分钟,弃上清,留沉淀 并用吸管打匀。
5、低渗处理(hypotonic treatment) 加8毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液(hypotonic solution), 用吸管打匀使细胞 悬浮于低渗液中,37℃水浴箱静止25-30分钟。
细胞会出现轻度固缩。 5、PHA的质量和浓度是培养成败的关键问题。PHA如果保存 时间太长,效价会降低,应在培养基中多加一些。 6、培养过程中,如发现血样凝集可轻轻震荡,使凝集块散开,
继续培养。
7、最好使用水平式离心机,离心速度不易过高,否则沉降在 管底的细胞团不易打散;反之,离心速度太低,细胞会丢失。
实验一 人类外周血染色体标本制备
一、实验目的 初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。 二、实验原理 正常情况下,外周血中的小淋巴细胞,几乎都处在G1期或G0
期,外周血细胞中是没有分裂相的。1960年发现外周血中的小淋
巴细胞可以在植物血凝素 (phytohaemagglutinin, PHA) 分裂刺激剂 的影响下,在形态上转变为淋巴母细胞,进行有丝分裂。这样经 过短期培养,秋水仙素的处理,低渗和固定,就可以迅速而又简 便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。本方法已为临床医
14、染色( Giemsa staining) Giemsa染液染色8分钟,玻片用自来水冲洗,晾干。 15、镜检(microscopic examination)
四、试剂和药品 1、 培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80%
小牛血清(56℃水浴灭活30分钟)
植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质) 青霉素终浓度 链霉素终浓度
100毫升生理盐水中。高压灭菌,冰箱保存备用。
3、秋水仙素:10微克/毫升,作为有丝分裂的阻止剂,抑
制细胞分裂时纺锤体wenku.baidu.com成,使细胞分裂停止在中期。称 10毫
克秋水仙素溶于100毫升生理盐水中,配成100微克/毫升的原 液,分装小瓶,高压灭菌,-20℃冰箱保存。临用时取上述原 液用生理盐水稀释成10微克/毫升。 4、 0.075MKCl:0.559克氯化钾溶于100毫升双蒸水中。
8、培养失败的可能原因:
培养瓶等器材洗涤不合要求。
配制培养基溶液的二或三蒸水不合要求。 PHA和培养基存放时间过长。 无菌操作不符合要求,发生细菌污染。 9、标本质量不佳的原因: (1)秋水仙素处理不当。 (2)低渗处理不当,低渗时间的掌握与气温有关。
(3)离心速度不合适。
(4)固定不充分:如固定液不新鲜,染色体形象模糊,呈 毛刷状,染色体周围有胞浆背景。因此,固定液纯度要高, 临用时新鲜配制。
不能立刻培养,应置于4℃冰箱,保存时间过久会影响细胞活力。
4、温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血中淋巴细胞 培养最适温度为37℃0.5℃,温度过高过低都将影响细胞的生长, 但细胞对低温比对高温耐受力强;若是中途停电,可相应延长培
养时间。培养液的最适pH7.2-7.4。pH偏酸,细胞发育不良,偏碱
学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
三、实验步骤 1、采血 (已完成) 2、培养(lymphocytes cell culture) (已完成)
RPMI1640培养液,37℃0.5℃恒温中培养72小时。
3、秋水仙素(colchicine)处理 在终止培养前2-3小时,加入秋水仙素。 (已完成)
五、注意事项 1、采血接种培养时,注意加入适量的肝素。 2、培养基中不含 L-谷氨酰胺,则溶解有RPMI1640培养基 的液体可先用浓盐酸调 pH值等于4,然后高压灭菌(注意121℃, 15磅,灭菌15分钟)。冷却后,再加入L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、
PHA、灭活小牛血清和双抗。
3 、接种的血样愈新鲜愈好,最好在 24 小时内培养。如果
10、再固定: 加入固定液(甲醇︰冰醋酸 = 1︰3),固定 20分钟。
11、再离心
1000转/分离心10分钟,弃去上清液,留沉淀。
12、再固定 加入固定液(甲醇︰冰醋酸 = 1︰1)打匀,固定 20分钟。
13、制片
固定后, 1000rpm离心10分钟,留下 0.2ml 沉淀物,吸取细胞 悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上,立即用嘴吹散,在洒精灯 焰上通过几次,使细胞平铺于载玻片上,空气干燥(dir drying)。
5、 甲醇 ( methanol )
6、 冰醋酸 (acetic glacid)
二者以不同比例配合使用
新鲜配制
7、吉姆沙染液(Giemsa)
吉姆沙由天青、伊红和甲基蓝组成 先将0.5克吉姆沙粉未干研磨,加33毫升60℃预热的纯甘油,在研钵 中研磨,在60℃水浴中保温90分钟。冷却后,再加入33毫升甲醇,滤纸 过滤,收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入 磷酸缓冲液即可染染色体标本。
1份Giemsa原液+ 9份磷酸缓冲液
8、磷酸缓冲液(pH 6.8)
溶液A:磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078克溶于1000毫升蒸馏水中。 溶液B:磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876克溶于1000毫升蒸馏水中。 100毫升缓冲液:需溶液A50.8毫升,溶液B49.2毫升。