纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白

纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白(作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ )

【摘要】建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体并进行表面修饰，在其表面固定特异性蓖麻毒单抗并作为探针，用于蓖麻毒蛋白的检测。米用场流分离技术对纳米颗粒探针进行准确表征，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。结果表明：通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与蓖麻毒蛋白等核糖体失活蛋白的特异性结合，应用于目标蛋白的检测。

【关键词】纳米颗粒探针；蓖麻毒素；核糖体失活蛋白；场流分离；扫描电镜；聚苯乙烯

1引言

核糖体失活蛋白(Ribosome ］inactivating proteins, RIP)存在于

许多植物中，植物核糖体失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病虫害或者恶劣的环境［1］。根据蛋白质的一级结构，RIP可以分成两类：1型，由一条多肽链组成;H型，是双链蛋白。H型双链RIP由2 条

或者4条多肽链组成，分子量约为60或120 kDa，其中一条是A (Active)链，具有N［糖苷酶活性；另一条是B (Binding)链，这两条链通过二硫键和非共价键连接［2,3］。蓖麻毒是一种典型的核糖体失活蛋白，由于蓖麻毒来源广泛，禁止化学和生物武器公约把蓖麻毒列为最为严格的控制对［4,5］。因此，开展对蓖麻毒等核糖体失活蛋白的检测研究具有重要意义［6〜8］。目前，检测核糖体失活蛋白的方法有免疫分析法和生物质谱法［9〜11］。纳米材料因具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高、表面原子所占比例大等特点而被广泛应用于蛋白检测中［12,13］。场流分离(Field flow fractionation, FFF)是Giddings 提出的一种新的分离分析理论［14,15］，它将流体与外加场联合作用于样品，实现样品组分的分离。场流分离技术可分离提纯、收集流体中范围为0.02〜1呵的悬浮物颗粒，也可作为一种表征技术对样品中纳米颗粒的质量、密度、电荷及其它物理参数的准确测定。场流分离技术根据外加场的不同，可分为沉降场、流体场、热力场、电场和磁场等多种分支，其中沉降场流分离(Sedime ntatio n field flow fractionation)技术较为完善且应用较多［16,17］。

本研究建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体，经表面修饰后在其表面固定特异性单抗，利用沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征，测量出单个聚苯乙烯纳

米颗粒结合的目标分子数目，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与核糖体失活蛋白的特异性结合，可

应用于目标蛋白的检测。

2实验部分

2.1仪器与试剂

沉降场流分离仪(Postnova, UT, USA);Anton Paar DMA (60/602)振动管密度计(奥地利Anto Paar公司);场发射扫描电镜(LEO 1550 EDS/OPAL/EBSD/STEM, Zeiss, Thornwood, USA); Sputter Coater SC7640 离子溅射仪(Quorum Tech no logies, UK); NAP]5及NAP[10凝胶渗透柱(通用公司);5417C离心机(德国Eppendrof 公司)。

蓖麻毒素A链(Ricin A Chain,纯度98.99%)及其单抗IgG均由美国农业部西部研究中心友情提供；聚苯乙烯纳米颗粒(240 nm，10%，w/V, Bangs Laboratories Inc. PA, USA);NH4HCO3 (99.5%)

、

表面活性剂FL_70(Fisher公司);实验用水为Milli^Q超纯水(18 M Q)。纳米颗粒探针制备用试剂套装(含聚氧乙烯]聚氧丙烯[聚氧乙烯嵌段共聚物(F108_PDS)、3(2吡啶二巯基)丙酸N羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、二硫苏糖醇(DTT)和磷酸盐缓冲液，pH 7.4)购自Sigma公司。

2.2实验方法

2.2.1离心沉降分离检测技术场流分离技术可视为一种单相的色谱技术，其系统设计为在超薄的样品分离通道的垂直方向上引入一个可调控的外加场(如重力场、离心场等)[11〜13]。含有纳米颗粒悬浮液样品在流动相的作用下流过分离通道。当样品进入通道后，样

品将暂停一段时间(即Relaxation time，停留注射或松弛步骤)。此时

样品中的不同组分由于物理性质的差异，在外加场的作用下，靠近

通道壁的流体比中心处流得慢，不同质量的纳米颗粒在通道中的流速差别会导致其相应的保留时间较大的差异，在流体及外加场的联合作

用下，样品组分就得到了分离，沉降场流分离仪结构[18]及分离原理

如图1所示。

分析化学第38卷第5期全灿等：纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白图1 (a)沉降场流分离仪结构图[18]和(b)沉降场流通道分离原理示意图

Fig.1 (a) Structure diagram of the field _flow fractionation(FFF) system[18]a nd (b) worki ng prin ciple scheme of FFF cha nnel 纟纳米颗

粒在尺度为940 mm X20 mm >0.254 mm的线型光滑通道中进行，该

通道的空隙保留体积为4.49 mL，死体积为0.439 mL，外加场为离心力场。检测时将线型光滑通道置于离心场中随离心机轴向旋转，距离离心机轴的径向距离为15.5 cm。流动相为流速为1.5 mL/min的0.1% FLJ0溶液。样品进样体积为10山，松弛时间为12 min以确保样品在分离通道中平衡，离心机转速500〜2000 r/min，紫外检测器波长为254 nm。聚苯乙烯纳米颗粒的密度为1.053 g/cm3[19]。利用振动管密度计测定0.1% FL_70的流动相密度为997.1 kg/m3 [20]。

2.2.2纳米颗粒表面修饰利用修饰剂F108]PDS对聚苯乙烯表面