(完整版)第三章细胞生物学研究方法总结

第三章 细胞生物学研究方法

第一节 细胞形态结构的观察方法

分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm

一、光学显微镜技术 （light microscopy ）

（一）普通复式光学显微镜技术

a ． 光学放大系统：目镜和物镜

光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片

组成 机械和支架系统

b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长

D ＝ α为物镜镜口张角

N ·sin α/2 N 为介质折射率

c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm ）、染色

（二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位）

1． FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术

2． 不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光

素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。

（三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ）

1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰

分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。

通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。

2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。

（四）相差和微分干涉显微镜技术

1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ）

光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。

2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。

二、电子显微镜技术（electron microscope ）

（一） 电子显微镜基本知识

1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像

2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大

分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。

3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜

基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等

真空系统：用两级真空泵不断抽气

记录系统：荧光屏或感光胶片成像

（二） 主要电镜制样技术介绍

制样要求：①要求样品很薄（数十纳米） ②要求保持精细结构

1．超薄切片技术

①固定：保持样品形态结构，甚至超微和分子水平上结构。

固定剂：常用饿酸（OsO 4）和戊二醛等，另外有物理方法如高频微波。

②脱水

③包埋：使样品中各种细微结构得到支撑，使切片连续完整并有足够强度。

包埋剂常用环氧树脂。

④切片：厚度40-50nm，通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩来控制。

切片刀：玻璃或钻石刀，常用玻璃刀。切片置于覆有支持膜的载网上。

⑤染色：用重金属盐染色。如锇酸染脂肪、铅盐染蛋白质、醋酸铀染核酸等。

通过电子束振幅的改变只能得到黑白图像。还可以与其他技术结合。

2．负染色技术（negative staining）

用的是重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀，载网上铺上重金属盐，衬托出样品。

3．冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术

冷冻断裂：快速低温冷冻样品（液氮或液氦中），然后样品在其结构相对脆弱的部位断裂。用另一些方法增强效果。

冷冻蚀刻（freeze etching）：主要用来观察膜断裂面的蛋白颗粒和膜表面结构，不需包埋也不需固定。冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）4．电镜三维重构技术

基本步骤：对生物样品在电镜中的不同倾角下拍照，得到的电镜图片再经变换处理形成复合物三维结构的电子密度图。低温电镜技术、玻璃态、结构生物学。

5．扫描电镜技术（scanning electron microscope，SEM）

主要用来观察样品表面的形貌特征，用CO2临界点干燥法解决表面张力问题。

扫描电镜景深长，成像具有强烈的立体感。分辨本领可达0.7nm 。

三、扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）

利用量子力学中的隧道效应观测物质表面的形貌。

主要装置：XYZ三个方向扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。

主要特点：①原子原子尺度的高分辨本领，侧分辨率0.1-0.2nm,纵分辨率0.001nm

②可以在真空、大气、液体等多种条件下工作。③非破坏性测量。

原子力显微镜（atomic force microscope）等十余种扫描探针显微镜。

第二节细胞组分的分析方法

一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物

差速离心（differential centrifugation）：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，

将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。

密度梯度离心：将要分离的组分铺放在含有密度逐渐增加的、形成密度梯度的、高

溶解性的、惰性物质溶液表面进行离心，形成不同的沉降带。

二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法

利用显色剂与被检物质的特殊基团反应显色来判断。

DNA：福尔根（Feulgen）反应特异显示DNA分布。

多糖：PAS反应（即醛基与希夫schiff试剂反应呈紫红色）

脂肪酸：四氧化饿（结果呈黑色）、苏丹Ⅲ（深红色）、苏丹黑

蛋白质：很多检测方法，如米伦（Millon）反应（红色沉淀）、重氮反应、“－SH”

酶：大多数固定剂对酶有钝化作用，定性研究时，保持酶活性，与适宜底物温育。

三、特异蛋白抗原的定位与定性

胞内蛋白定位：免疫荧光与免疫电镜

蛋白质体外分析定性：免疫印迹和放射免疫沉淀。

（一）免疫荧光技术（immunofluorescence technique）