生物催化剂的发现

培养与发酵
（5）发酵试验的三个阶段
2.2.2 从极端微生物中筛选极端酶的策略

极端酶（extremozyme）
是由极端微生物（extremophile）产生的酶，与之相对应的 中间型是常态微生物（mesophilic organism）产生的酶。

如何进行极端酶的研究和开发
①必须有足够的酶，这就涉及极端微生物的培养 ②依赖极端酶在中间宿主中的表达
极端环境中的微生物
极端环境：高等动植物不能生长，大多数微生物
不能生活的高温、低温、强碱、强酸、高盐、高压、高辐
射、等特殊环境。
◆1 种类：极端嗜热菌，最适生长温度90～105℃，高达110℃
极端嗜冷菌，可在零下70～80摄氏度度生长。 极端嗜盐菌，新疆盐湖中的可耐受20～30％的NaCl 极端嗜碱菌，PH 9～10 极端嗜压菌，在深海底，生活压力7.1～8.1×107Pa
主底物 辅助底物
酶催化剂 反应介质
生物催化反应体系
生产率 选择率
主产品
副产物
第二章
生物催化剂的来源与筛选
大 纲

2.1 概述 2.2 微生物酶筛选的策略 2.3 微生物和酶的一般筛选方法 2.4 优良菌种选育 2.5 从基因组DNA筛选酶的方法




2.1 ห้องสมุดไป่ตู้ 述
2.1.1 生物催化剂的概念
上节课内容复习
• 生物催化定义：是利用生物催化剂(主要是酶或微生物) 来改变(通常是加快)化学反应速度的作用。 • 生物催化转化的分类： (1)发酵：用活细胞将原材料(如糖、淀粉或甲醇)转化成 更复杂的目标产物。 (2)前体发酵：发酵过程中添加前体物质，并由活细胞将 其转化成目标产物。 (3)生物转化：用酶或静息细胞经过一系列步骤，将前体 转化成目标产物。 (4)酶催化：提取粗酶或部分纯化的酶，将底物转化成目 标产物。
复筛
1 2 3 4 微生物初筛鉴定 发酵培养基的选择 培养与发酵 抽提试验
复筛
培养与发酵
（1）试管培养 试管摇床培养。常用。 目的：原种斜面培养后，为了提高初筛效率。
（2）摇瓶培养（摇瓶发酵） 250或500ml锥形瓶再200rpm摇床上培养。 目的：培养基和培养条件的初筛。
培养与发酵
（3）玻璃自控发酵罐 容量5～50L。是摇床向发酵罐的过渡阶段。 目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。 （4）试验罐培养 中间工业试验阶段 目的：放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规 律和发酵参数。为工业规模生产打基础
β -葡萄糖苷酶 β -木糖苷酶 β -半乳糖苷酶
纤维二糖水解 木二糖水解 乳糖水解
105 未 定 80
2.2.3 未培养生物催化剂的发现策略

未培养微生物（uncultured microorganism）
美国微生物学家Colwell的实验室在1982年首先提出
“不能培养微生物（nonculturable microorganism）” 的概念，他们发现快速生长的霍乱弧菌和大肠杆菌移植到 无营养料的盐水中，经长时期的低温保存后，细胞数不减， 代谢活力不变，但在正常肉汤培养条件下不产生菌落，因 此他们用“活的但不能培养（viable but nonculturable, VBNC)”一语描述这种潜伏状态的细菌。
以便于分离纯化。
①生产菌种应该具备在较短的发酵周期内产生大量发酵物 ②在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的反应产物或副产物， ③能利用多种来源的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性较小，可用价 廉易得的原材料进行培养，以降低发酵成本。 ④对需要添加的前体物质（底物）有耐受力，并且不将底物、产物作为一般
2.3 微生物和酶的一般筛选方法

(1) (2)
2.3.1从自然界发现产酶微生物
采样 富集培养：是根据微生物的生理特点，在目的微生物含量较少时，设计一种 选择型培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下迅速地
生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣种变成人工环境下的优势种。 分为分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种不同的方式。
USA
Osaka, Japan Korea USA Japan USA
Russian Collection of Russia Microorganisms National Research Center of Russia Antibiotics National Collection of Type Culture United Kingdom 英国国家酵母菌种收藏中 National Collection of Yeast Culture United Kingdom 心
◆2 特性
都为古细菌。具有不同于一般微生物底遗传机制、
特殊底细胞结构和生理功能。
◆3 应用
开采石油：嗜压菌产气增压降低原油粘度。 生产特殊酶制剂：嗜碱细菌产生的蛋白酶作为洗 涤剂的添加剂 环境保护：嗜碱芽孢杆菌产生的木聚糖酶能够水解
木聚糖产生木糖和寡聚糖，可用来处理人造纤维废物
遗传工程以及基因技术：从水生栖热菌中提取耐 热的Taq DNA聚合酶
碳源利用。
⑤具有抗杂菌污染，抗噬菌体感染的能力。 ⑥发酵泡沫少，利于提高装料系数、提高单罐产量、降低发酵成本 ⑦生长繁殖能力强，有较快的生长速率，遗传特性稳定。
2.4.1 自然选育

自然选育（spontaneous mutation）：未经人
工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。
多因素低剂量的诱变效应
生物催化剂筛选的主要途径
（1）从商品酶库中筛选 （2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选 生物催化剂 （3）从自然界发现和筛选产酶微生物 （4）从基因库筛选
从商品酶库中筛选
丹麦的Novo Nordisk公司和美国的"Genecor国际 公司"两家。它们的销售额分别占世界酶制剂市场 份额的44%和29%。英荷合资的皇家DSM-吉斯特 公司近年来已迅速崛起并成为全球第3大酶制剂 生产企业。该公司的酶制剂销售额约占世界酶制 剂市场的15~19%。至于其它中小型酶制剂公司 只能分享10%不到的酶制剂市场份额。
生物催化剂筛选的反应过程的设计

例：①生物法：腈水合酶与酰胺酶催化反应生产丙烯酰胺
H2O
CH2＝CH－CN 腈水合酶 CH2＝CH－CONH2
H2O
CH2＝CH－COOH 酰胺酶
• ②传统法：铜催化丙烯腈的水合生产丙烯酰胺
催化剂的回收制备 丙烯腈 除去O2 水
水合作用
催化剂的分离
浓缩
除去Cu离子，脱色
未反应的丙烯腈
丙烯酰胺产物
酶或产酶微生物的筛选
一般产酶微生物筛选的原则
①能够通过发酵在相对较短的时间内高产目标酶； ②微生物应该尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； ③微生物所产生的酶最好有比较高的专一性 ④所采用的微生物应该是不产生有害物质的非致病性的安
全微生物
⑤微生物的遗传稳定性应该比较高

百分比 4 12 0.1-1 5
藻类
苔藓植物 裸子植物 被子植物
40000
17000 750 250000
60000
25000 270000
67
68 93
原生动物
30800
100000
31
2.1.3 生物催化剂的寻找和发现
提高筛选效率的基本原则
①需要设计合适的用酶方法，使得目标反应非常清楚 ②需要在有希望的微生物中寻找具有合适活性的微生物
从自然界发现和筛选产酶微生物
建立有效和方便的筛选分析方法
成功的选择方法是基于目标酶活而精心设计的。 为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的 是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来， 使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。
(3) (4)
分离 筛选
图2-2 从自然界发现产酶微生物的方法
2.3.2 生物催化剂的高效筛选

高通量筛选（high-through screening, HTS）是
近年来发展起来的一种新型筛选技术，其特点
是微量、快速、灵敏、准确，在短时间内可以
检测大量的微生物。
2.4 优良菌种选育

优良生产菌种应该具备的基本特点：
1.生物催化剂：是生物反应过程中起催化 作用的游离或固定化酶的总称。 2.分类
结构 细胞 酶 多细胞生物体
游离型催化剂
形式 固定化催化剂
2.1.2 生物催化剂来源与多样性
8% 4%
生境的概念
微生物 动物 植物
88%
生物 病毒 细菌 古细菌 真菌
已知种类 5000 4760 500 69000
估计总种类 130000 40000 1500000
（一）目的：得到具有潜在应用价值的目的微生物。 （二） 要求：
快速——有预测或预见 敏捷——迅速处理好众多的样品。 经济——得到有广泛目标的有用微生物。
二 初筛
（三）筛选方法 琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛。
1 用PH指示剂检测有无有机酸或胺类。 中性麝香草酚蓝:PH＜6.0黄,PH ＞7.6蓝,PH6.0~7.0绿 2 在培养基中加入碳酸钙检测有机酸。 可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区。 3 在培养基中加入底物检测细胞外酶、酶抑制剂等 特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反应 对特定底物形成溶解或沉淀。

复壮
互变异构效应
2.4.2 诱变选育

诱变育种的原理
③需要建立方便和敏感的分析系统尽可能多的搜寻微生
物样本。
2.2 微生物酶筛选的策略

2.2.1 常规生物催化剂筛选的一般策略
设计反应过程
选择合适的酶或产酶微生物 建立有效且方便的分析方法
生物催化剂筛选的反应过程的设计
图2-1 海因酶和N-氨基甲酰氨基酸水解酶两步选择性 水解制备D-对羟基苯基甘氨酸
从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选
英文简称 ACCC CCCAU CCTCC CCVCC CFCC CGMCC CICC CMCC CMMC CPCC CVCC MCCC SIIA 中文全称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 中国农业大学菌种保藏中心 中国典型培养物保藏中心 中国普通病毒保藏管理中心 中国林业微生物菌种保藏管理中心 中国普通微生物菌种保藏管理中心 中国工业微生物菌种保藏管理中心 中国医学微生物菌种保藏管理中心 中国海洋微生物保藏中心 中国药用微生物菌种保藏管理中心 中国兽医微生物菌种保藏管理中心 中国海洋微生物菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 所属单位 中国农业科学院农业资源与农业区 划研究所 中国农业大学 武汉大学 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院森林生态环境与保 护研究所 中国科学院微生物研究所 中国食品发酵工业研究院 中国药品生物制品检定所 中国水产科学研究院黄海水产研究 所 中国医学科学院医药生物技术研究 所 中国兽医药品监察所 国家海洋局第三海洋研究所 所在地 北京 北京 武汉 武汉 北京 北京 北京 北京
表2-1 某些有应用前景的超级嗜高温酶
酶
葡萄糖异构酶 木聚糖酶 α -淀粉酶 纤维二糖水解酶 β -葡聚糖酶A， β -葡聚糖酶B β -甘露聚糖酶 α -半乳糖苷酶
功 能
葡萄糖→果糖，生产高果糖糖浆 木浆和纸生产中水解木聚糖 淀粉水解 纤维素水解 纤维素水解 甘露聚糖水解 半乳甘露聚糖水解
酶活力的最适温 度/℃ 95 105 85~90 105 95 92 100~105
平皿快速检测法 平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生 理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体 的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，。 这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以 大大提高筛选的效率。
初筛
初筛 出来。 一次或多次从现有菌群中把多数无用的 微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选
北京 北京 厦门 成都
从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选
ATCC
IFO KCTC FDA NIHJ NIH VKM NRCA NCTC NCYC 美国国立卫生研究院 美国食品与药品管理局
美国典型菌种收藏中心
日本大阪发酵研究所
American Type Culture Collection
Institute for Fermentation Korean Collection for Type Cultures Food and drug Administration National Institute of Health National Institute of Health