常用的定量PCR荧光探针-生物化学与分子生物学
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关键点3：确保检测的灵敏度足够高。 关键点4：确保样本质量合格。 关键点5：确保实验试剂质量合格。 关键点6：确保实验过程规范。
关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。
关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证， 确保实验结果可靠。
8
核酸实验研究技术进展－1
2)
Southern blotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。 Northern blotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。 目标DNA分子原位杂交检测。 目标RNA分子原位杂交检测。
3
核酸实验研究技术进展－1
杂交法的优点与缺点：
优点： Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。
4
核酸实验研究技术进展－1
例一： cDNA microarray 检测SHEEC食管 癌细胞NGAL基因 mRNA转录实验 结果 反向 Dot blotting
5
核酸实验研究技术进展－1
例二： Northern blotting检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
化学发光法
例子：RT-PCR 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果 A B M A B M
NGAL 600bp
GAPDH 226bp
A: 永生化食管上皮细胞SHEE B: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
20Baidu Nhomakorabea
核酸实验研究技术进展－1
9
核酸实验研究技术进展－1
例子： RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果 NGAL 600bp
S
M
S: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
10
核酸实验研究技术进展－1
确保PCR法实验成功的八个关键点：
关键点1：确保实验方案设计合理。 关键点2：确保引物的特异性充分。 关键点3：确保样本质量合格。 关键点4：确保实验试剂质量。
关键点5：确保实验过程规范。
关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。 关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。 关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证， 确保实验结果可靠。
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核酸实验研究技术进展－1
3)
测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大 致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含
两个问题： 反转录PCR实验是否需要探针 ？
Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于 RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。
Southern blotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。
缺点： Dot blotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子 外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸 分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核 酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结 果。 Northern blotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容 易导致假阴性结果。
证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法： 1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。
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核酸实验研究技术进展－1
1)
杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。 Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体 上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。
A 永生化食管 上皮细胞 SHEE 判断标准： B/A 2或 0.5为显著性 差异表达 实际情况： B/A＝3.53 B 食管癌细胞 SHEEC
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核酸实验研究技术进展－1
通过 RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验 标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－1
PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。 优点： 实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统 中所存在的1个拷贝目标核酸分子。 阴性结果的可信度很
高。
缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验 过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实， 因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。
NGAL
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核酸实验研究技术进展－1
例三： Northern blotting 检测缺 氧复氧条件下心 肌细胞EGR1基 因转录mRNA 实 验结果
同位素法
EGR1
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核酸实验研究技术进展－1
确保杂交法实验成功的八个关键点：
关键点1：确保实验方案设计合理。
关键点2：确保探针的特异性充分。
量上可能有显著差别，然而序列未知。
优点： 可信度最高。 对于解析鉴定未知核酸分子序列片
段是必需的手段。
缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初
测序图时要格外小心。
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核酸实验研究技术进展－1
目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子
13
核酸实验研究技术进展－1
Poly A tail
核酸实验研究技术进展－1
生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定
必须回答如下三个基本问题：
目标核酸分子是否存在于实验标本中。 实验标本中目标核酸分子的含量是多少。 实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本 中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。
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核酸实验研究技术进展－1
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核酸实验研究技术进展－1
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核酸实验研究技术进展－1
测定实验标本中目标核酸分子的含量
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核酸实验研究技术进展－1
通过 Dot blotting，结合斑点光密度扫描分析， 测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子或 目标DNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－1
例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 检测 SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。
关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证， 确保实验结果可靠。
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核酸实验研究技术进展－1
2)
Southern blotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。 Northern blotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。 目标DNA分子原位杂交检测。 目标RNA分子原位杂交检测。
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核酸实验研究技术进展－1
杂交法的优点与缺点：
优点： Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。
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核酸实验研究技术进展－1
例一： cDNA microarray 检测SHEEC食管 癌细胞NGAL基因 mRNA转录实验 结果 反向 Dot blotting
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核酸实验研究技术进展－1
例二： Northern blotting检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
化学发光法
例子：RT-PCR 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果 A B M A B M
NGAL 600bp
GAPDH 226bp
A: 永生化食管上皮细胞SHEE B: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
20Baidu Nhomakorabea
核酸实验研究技术进展－1
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核酸实验研究技术进展－1
例子： RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果 NGAL 600bp
S
M
S: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
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核酸实验研究技术进展－1
确保PCR法实验成功的八个关键点：
关键点1：确保实验方案设计合理。 关键点2：确保引物的特异性充分。 关键点3：确保样本质量合格。 关键点4：确保实验试剂质量。
关键点5：确保实验过程规范。
关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。 关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。 关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证， 确保实验结果可靠。
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核酸实验研究技术进展－1
3)
测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大 致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含
两个问题： 反转录PCR实验是否需要探针 ？
Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于 RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。
Southern blotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。
缺点： Dot blotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子 外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸 分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核 酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结 果。 Northern blotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容 易导致假阴性结果。
证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法： 1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。
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核酸实验研究技术进展－1
1)
杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。 Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体 上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。
A 永生化食管 上皮细胞 SHEE 判断标准： B/A 2或 0.5为显著性 差异表达 实际情况： B/A＝3.53 B 食管癌细胞 SHEEC
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核酸实验研究技术进展－1
通过 RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验 标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－1
PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。 优点： 实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统 中所存在的1个拷贝目标核酸分子。 阴性结果的可信度很
高。
缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验 过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实， 因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。
NGAL
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核酸实验研究技术进展－1
例三： Northern blotting 检测缺 氧复氧条件下心 肌细胞EGR1基 因转录mRNA 实 验结果
同位素法
EGR1
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核酸实验研究技术进展－1
确保杂交法实验成功的八个关键点：
关键点1：确保实验方案设计合理。
关键点2：确保探针的特异性充分。
量上可能有显著差别，然而序列未知。
优点： 可信度最高。 对于解析鉴定未知核酸分子序列片
段是必需的手段。
缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初
测序图时要格外小心。
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核酸实验研究技术进展－1
目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子
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核酸实验研究技术进展－1
Poly A tail
核酸实验研究技术进展－1
生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定
必须回答如下三个基本问题：
目标核酸分子是否存在于实验标本中。 实验标本中目标核酸分子的含量是多少。 实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本 中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。
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核酸实验研究技术进展－1
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核酸实验研究技术进展－1
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核酸实验研究技术进展－1
测定实验标本中目标核酸分子的含量
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核酸实验研究技术进展－1
通过 Dot blotting，结合斑点光密度扫描分析， 测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子或 目标DNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－1
例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 检测 SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果