第六章重组体的筛选与鉴定

一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
载体 筛选
• 噬菌体包装容量的正性筛选 • 质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法) 质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法) • 标记补救筛选
间接 筛选
• • •
翻译产物(Western blot) 翻译产物( ) 转录产物( 转录产物(Norther blot) ) 其他方法(报告基因 其他方法(报告基因)
同样, pBR322质粒的Amp 基因序列中,利用PstⅠ 同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ 质粒的 限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也 限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段, DNA片段 能应用插入失活作用检测重组质粒,当然, 能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选 的菌落就应该是具有Amp 的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型
•载体和一个或数个串联目的基因连接 •载体发生自连 •目的DNA分子发生自连 目的DNA DNA分子发生自连 •未发生连接反应的载体和目的DNA片段(更 未发生连接反应的载体和目的DNA片段( DNA片段
多)
为什么对重组子要进行鉴定筛选? 为什么对重组子要进行鉴定筛选? 因此,在成千上万个转化子中， 因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的 重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿 重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿 DNA分子的比例很少 含有外源DNA 主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开， 主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有 不含外源DNA的宿主细胞分开 正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细 正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细 的宿主细胞和含有其他外源DNA 胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方 分开， 案并加以验证。 案并加以验证。
为什么对重组子要进行鉴定筛选? 为什么对重组子要进行鉴定筛选? 在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA 在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA 分子,即使所有的受体细胞都变为转化体, 分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转 化子仍是多种类型的DNA分子, 化子仍是多种类型的DNA分子,原因是在连接反应中会 DNA分子 有以下几种情况发生: 有以下几种情况发生:
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（2）筛选重组体的原理 在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用， 这两个基因内的任一插入作用， 都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活， 基因或 基因出现功能性失活， 出现功能性失活 都会导致 于是，所形成的重组质粒都将具有 于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或 Amprtets的表型。 的表型。
第六章 重组体的筛选与鉴定
将目的基因与载体连接形成重组子, 将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种 方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组 方法将重组子导入宿主细胞, DNA的转化子是基因工程的目的所在. DNA的转化子是基因工程的目的所在. 的转化子是基因工程的目的所在 何谓转化子? 何谓转化子? 所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标 所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标 转化子就是导入外源DNA 志的细菌细胞 其他受体细胞. 细菌细胞或 志的细菌细胞或其他受体细胞.
PI lacI
PZYA
RNA聚 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 合酶
lacO
lacZ
lacY
lacA mRNA
mRNA
阻遏蛋白
β-半乳 β-半 糖苷酶 乳糖苷 透过酶
β-半乳糖 苷乙酰基 转移酶
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 2.β 2.β-半乳糖苷酶显色反应筛选法原理 有许多质粒载体具有β 有许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检 测功能. 测功能. 应用这些载体系列，当外源DNA插入到它的lacZ基 应用这些载体系列，当外源DNA插入到它的lacZ基 DNA插入到它的lacZ 上时，可造成β 半乳糖苷酶的失活效应， 因上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活效应，就可通过 大肠杆菌转化子菌落在添加X gal-IPTG培养基中的颜 大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜 培养基中的 鉴别出重组子和非重组子。 色变化鉴别出重组子和非重组子 色变化鉴别出重组子和非重组子。
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 3. 举例 当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白 当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白 具有酶活性 的存在下被IPTG(异丙基-β-D质,它在生色底物X-gal的存在下被 它在生色底物 的存在下被 (异丙基硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入 硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入 蓝色菌落 质粒的多克隆位点上后， 到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改 质粒的多克隆位点上后 则会导致读码框架改 表达蛋白失活，因此， 失活 变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒 的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。 的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因 白色菌落 此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质 根据这种β 半乳糖苷酶的显色反应， 粒与自身环化的载体DNA分开。 粒与自身环化的载体DNA分开。 DNA分开
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 3.举例 3.举例 pUC质粒：带有 -半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控 质粒： 质粒 带有β-半乳糖苷酶基因（ ） 序列和 -半乳糖苷酶N 个氨基酸的编码序列。 序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这 个氨基酸的编码序列 个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位 点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。 的阅读框架。 点的多克隆位点，但并没有破坏 没有破坏 的阅读框架 大肠杆菌菌株：带有 -半乳糖苷酶C端部分序列的 大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶 端部分序列的 编码信息。 编码信息。 在各自独立的情况下， 在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的 质粒和大肠杆菌编码的 β-半乳糖苷酶片段都没有活性。 半乳糖苷酶片段都没有活性。
质粒DNA 当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或 外源DNA片段插入 DNA片段插入 质粒DNA的 Ⅰ SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（Tetr Ⅰ位点时，抗四环素基因失活（ Tets ），重 ），重 表型。因此， 组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌 组体转化子必定具有 先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的 的琼脂平板上， 先涂布在含有 的琼脂平板上 并将存活的Ampr菌 原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上 到另一个含有 的琼脂平板上， 落原位影印到另一个含有 的琼脂平板上，凡是在 Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必 平板上生长， 不在 平板上生长的菌落， 平板上生长 平板上生长的菌落 已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆. 片段的重组质粒转化子克隆. 定是已经插入了外源 定是已经插入了外源 片段的重组质粒转化子克隆
第一节 遗传学检测法 一、根据载体表型特征的筛选 根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选, 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是 一种比较简单而又十分有效的方法。 基因工程中使 一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使 比较简单而又十分有效的方法 用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常 用的所有载体分子, 至少含有一个选择标记。质粒常 有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、 抗生素抗性基因, 氨苄青霉素抗性基因（ 四环素抗性基因（ ）、卡那霉素抗性基因 卡那霉素抗性基因（ 四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr） 根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重 根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选, 组体DNA分子必不可少的条件之一。 组体DNA分子必不可少的条件之一。 DNA分子必不可少的条件之一
在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插 在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插 的方法是使用抗药性标记的 入失活作用,或是β 半乳糖苷酶基因的显色反应, 入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重 作用 组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来. 组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来. DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来 而对于λ噬菌体的置换型载体来说, 而对于 噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋 噬菌体的置换型载体来说 白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控 的能力是有一定限度的。 白容纳 的能力是有一定限度的 制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这 制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这 长度的75% 之间 ）， 样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性， 样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了 形成噬菌斑 体外重组所形成的有活性的λ重组体分子， 体外重组所形成的有活性的 重组体分子，一般都应带 重组体分子 有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体 有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是 重组体 DNA的插入片段 的形成本身就是 的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选， 的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选， 所以又称为平板筛选法。 所以又称为平板筛选法。 平板筛选法
常用的重组子筛选和鉴定方法
• 重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定) 重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定) DNA的快速提取鉴定 • 重组子酶切图谱鉴定 限制性核酸酶酶切片段 重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段
DNA 直接 筛选 重组 子的 筛选 鉴定 大小鉴定) 大小鉴定
• DNA序列分析 序列分析 • 同源性分析鉴定 原位杂交 同源性分析鉴定(原位杂交 原位杂交) • 质粒载体的抗性标记筛选