海藻酸裂解酶酶活力检测方法

2.范围

本标准适用于生物发酵产海藻酸裂解酶酶活力的检测。

3.酶活力单位定义

在40℃，pH为7.5条件下，在本方法规定反应体系下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和键，在235nm 下，吸光度每增加0.1，为一个酶活单位U。

4.原理

海藻酸裂解酶可以通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键，产生非还原性端具有不饱和双键，双键位于产物非还原末端C4、C5之间，并在235nm处产生最大紫外吸收。

5.试剂及仪器

5.1磷酸缓冲液（0.05M，pH7.5）

1）配制0.05M磷酸二氢钠溶液

称取3.9g二水合磷酸二氢钠，去离子水溶解后，定容至500mL。

2）配制0.05M磷酸氢二钠溶液

称取17.91g十二水和磷酸氢二钠，去离子水溶解后，定容至1000mL。

3）混合配制0.05M磷酸缓冲液

将步骤2中磷酸氢二钠溶液放置于2L烧杯中，用步骤1中磷酸二氢钠溶液调节其pH至7.5。

5.2底物，0.3%海藻酸钠溶液

取100mL小烧杯，加入约80mL磷酸缓冲液；

称取0.3g海藻酸钠，磁力搅拌条件下均匀加入到小烧杯中，搅拌至溶解；

用磷酸缓冲液定容至100mL，配制当天使用。

5.3终止液

0.06mol/L的磷酸终止液。根据不同的磷酸浓度进行计算。

6.主要仪器

6.1UV-752W型紫外－可见分光光度计，1cm比色皿。

6.2电热恒温水浴锅

6.3分析天平

6.4移液器

6.5磁力搅拌器

6.6pH计

7.测定

固体样品：准确称取固体酶制剂1.000g ，加入50mL 缓冲液，磁力搅拌30min ，4000转离心10分钟，取上清液。用缓冲液稀释至适当倍数，控制在吸光值OD 235在0.22-0.35之间，酶活约为0.5U/mL 。液体样品：用缓冲液稀释至适当倍数，控制在吸光值OD 235在0.22-0.35之间，酶活约为0.5U/mL 。

7.2测定步骤

酶反应：取三支15mm*150mm 试管，加入1.8mL 底物，40℃水浴预热5min ，加入稀释好的酶液0.2mL ，准确计时，涡旋震荡，40℃保温10min ，将试管从水浴中取出并立即加入2mL 磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

空白：取15mm*150mm 试管，加入1.8mL 底物，40℃水浴预热5min ，加入缓冲液0.2mL ，涡旋震荡，40℃保温10min ，将试管从水浴中取出并立即加入2mL 磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

比色：每个样品的空白和酶反应终止后，立即在235nm 比色，并记录吸光值A 0和A 样。

备注：

8.计算X=

N 1.0t 2)A -(A 0⨯⨯⨯样式中：

X —酶活力，U/mL 或U/g

2—加入2mL 磷酸终止液的体积系数

t （min ）—酶促反应时间（在酶反应的线性范围内）

0.1—体系系数，即将吸光值增长单位换算为0.1

N—稀释倍数

经简化：酶活力（U/mL ）=吸光值差值×2×N