实验八、转基因植株的分子检测

思考题
植物表达载体有哪些必备的功 能元件？ 影响限制性内切酶活性的因素 有哪些？ 简述获得转基因植物的基本流 程 试比较植物基因工程与常规育 种的优缺点 谈谈你对转基因植物安全性的 看法（100个字以内）
实验报告： 60分
思考题： 40分
最终成绩
PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石
PCR反应
PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction),是通
过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊
区域扩增出来的技术，分三个关键步骤：
变性
退火
延伸
PCR反应体系
50ul 体系：
Template: 1.0—700pg (1ul)
的靶片段 DNA
酶基因的拷贝数
Northern 杂交
Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方 法，通过Northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段 或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量 大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目 的片段。
实验八 、转基因植物PCR与 RT-PCR检测
王欢欢 2019.11
聚合酶链式反应
分子生物学
分子克隆
DNA序列分析
不受限制地制造大量的基因拷 贝的过程----聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction
----------K. B. Mullis 1990 2019年，美国科学家Mullis众望 所归获得诺贝尔化学奖。
基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等
Southern 杂交
具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程 是高度特异的.
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将 单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结 构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量
Primer:1：0.5umol/l (1ul)
Primer 2：0.5umol/l (1ul)
dNTP ：0.2mmol/l
(1ul)
10×buffer:
（5ul）
Taq enzyme： 2.5U (0.5ul)
ddH2O： -
(40.5ul)
变性 退火 延伸
PCR反应程序： 1. 95 ℃ 5 min 2. 94 ℃ 30 sec 3. 60 ℃ 30 sec 4. 72 ℃ 1 min 30 sec 5. 72 ℃ 10 min 6. 15 ℃ Over
30 Cycle
RT-PCR
Actin
Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一 种重要骨架蛋白，Actin在不同物种 之间高度保守，在动植物中广泛存在。 不同的actin之间同源性大于90%。
β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要 蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨 架微丝的主要成分。
β-Actin是PCR常用的内参，内参即是 内部参照（Internal Control），它们 在各组织和细胞中的表达相对恒定， 在检测蛋白的表达水平变化时常用它 来做参照物。
实时荧光定量PCR技术PCR (real-time quantitative PCR):在常规 PCR反 应体系中加入荧光标记探针或者荧光染料，利用荧光信号实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高 实验的重复性。
1983年4月一个星期五的晚上，在一 条被月光笼罩的通向北加利福尼亚红 树县的山路上。
不可思议的奇妙发现，220=？1048576
一个循环的产物成为下一个链式反应 的模板
PCR发展足迹
PE-Cetus公司推出了第一台 PCR热循环仪
嗜热水生菌的热稳定DNA聚合酶—Taq（T. aquaticus)，1976首次发现。 数年后用于PCR中，Saiki et al.1988 15年以后，使用大肠杆菌DNA聚合酶 I Klenow 片段进行DNA扩增 Kary Mullis. 1986 20世纪70年代早期提出体外扩增设想 Klepppe et al. 1971
DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基 因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等
基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差 异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达 差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证
Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine，David Kemp和 George Stark发明，Northern blotting实际上依照Southern blot（依 据生物学家 Edwin Southern 名字来命名）来命名
转基因植株的分子检测
转基因拟南芥种子的萌发及筛选
白菜型油菜Δ8-鞘脂脱氢酶基因的表达 模式
植物基因工程
一
植物基因表达载体设计与构建二ຫໍສະໝຸດ 碱裂解法小量制备质粒三
农杆菌感受态细胞制备及转化
四 农杆菌侵染法转化烟草及拟南芥
五
GUS染色检测基因瞬时表达
六
植物组织DNA的提取
七
植物组织RNA的提取
八 DNA的PCR检测，反转产物RT-PCR
实时荧光定量PCR
一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙 膜）上，即印迹（blotting）； 二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名
Southern 杂交验证拷贝数
拷贝数就是指某基因（可以是质粒）
在某一生物的基因组中的个数. 单
拷贝就是该基因在该生物基因组中
只有一个,多则指有多个。
Southern blot
Southern 法准确性高、特异性强，
但费时费力
实时荧光定量PCR
简便、快捷，能够有效扩增低拷贝 Southern 杂交分析白菜型油菜Δ8-鞘脂脱氢