发光细菌的研究和应用

发光细菌的研究和应用

①

杜宗军②　王祥红　李海峰　池振明

(中国海洋大学海洋生命学院　青岛266003)

摘　要　

发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌,主要分布在海

洋环境中。发光细菌及其发光基因在环境监测等领域中具有广泛的应用价值。本文综述了发光细菌的分类、发光机理及其应用。关键词　发光细菌,分类,发光基因,环境监测

1　发光细菌的分类

发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射

可见荧光的细菌,这种可见荧光波长在450～490nm 之间,在黑暗处肉眼可见。目前,全世界已命名的发光细菌有以下几种[1,2]:①属于异短杆菌属(Xenorhabdus )的有发光异短杆菌(Xenorhabdus l u 2mi nescens );②属于发光杆菌属(Photobacteri um )的有明亮发光杆菌(Photosbacteri um phosphoreum )和鳆发光杆菌(P.leiognathi );③属于希瓦氏菌属

(S hew anella )的有羽田希瓦氏菌(S hew anella hanedai ),以前也曾经把它归类为交替单胞菌属(A lteromonas )的海氏交

替单胞菌(A lteromonas hanedia );④属于弧菌属(V ibrio )的有哈维氏弧菌(V ibrio harveyi )、美丽弧菌生物型Ⅰ(V .splen 2di dus biotype Ⅰ)、费氏弧菌(V .f ischeri )、火神弧菌(V .logei )和东方弧菌(V .orientalis )。霍乱弧菌(V .cholerae )和地中海弧菌(V .mediterranei )中

的某些菌株有发光现象,曾有报道易北河弧菌(V .

albensis )有发光现象,后将其重新分类归入霍乱弧

菌(V .cholerae )。另外,我国学者分离得到一株淡

水发光细菌青海弧菌(V .qi ng 2

haiensis )[3],目前还没有进入伯杰

氏手册。

在以上发光细菌中,发光异短杆菌(Xenorhabdus l umi nescens )、霍乱弧菌(V .cholerae )和青海弧

菌(V .qi nghaiensis )属于淡水发光菌,其余都是海

洋细菌。发光细菌主要分布在海洋环境中。

2　发光细菌的发光机理

发光机理的研究表明[4,5],不同种类的发光细菌的发光机理是相同的,是由特异性的荧光酶

(L E )、还原性的黄素(FMN H 2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO )、氧分子(O 2)所参与的复杂反应,大致历程如下:

FMN H 2+L E →FMN H 2・L E +O 2→L E ・FMN H 2・O 2+RCHO →L E ・FMN H 2・O 2・RCHO →L E +FMN +H 2O +RCOOH +光

概括的说就是,细菌生物发光反应是由分子氧作用,胞内荧光酶催化,将还原态的黄素单核苷酸(FMN H 2)及长链脂肪醛氧化为FMN 及长链脂肪酸,同时释放出最大发光强度在波长为450～490nm 处的蓝绿光。其中三步反应产生三种中间产物,寿命极短,很难分离出来。

荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称,细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的单加氧酶,只有两个亚基共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取到的细菌荧光素酶其分子量差别较小。王安平等分离纯化了东方弧菌的荧光酶并对其酶学性质进行了研究,分离得到了两个分子量分别为44kD 和41kD 的亚基,该酶反应的最佳温度在18℃,超过25℃酶即迅速失活。

①②男,1974年生,硕士,讲师;研究方向:海洋微生物学;联系人。

(收稿日期:2003201223)

达尔文计划(162/8/065)资助项目。

3　发光细菌的应用

3.1　发光细菌在环境监测中的应用

环境中的污染物种类和数量日益增多,传统的分析鉴定手段难以达到实时、迅速、在线分析的要求。发展新的快速、准确评价各类污染物的毒性的有效方法显得非常迫切、必要。在急性毒性分析方面,新的检测手段在不断建立,其指示物包括酶、细菌、藻类、海洋浮游生物和鱼等。

发光细菌由于其独特的生理特性、与现代光电检测手段完美匹配的特点而备受关注,在环境监测中的应用也越来越广泛。发光细菌在正常的生理条件下能发出波长在450～490nm的蓝绿色可见光,在一定的试验条件下发光强度是恒定的。与外来受试物接触后,由于毒物具有抑制发光的作用,发光细菌的发光强度即有所改变,变化的程度与受试物的浓度在一定范围内呈相关关系,同时与该物质的毒性大小有关。外来受试物主要通过下面两个途径抑制细菌发光:①直接抑制参与发光反应的酶类活性;

②抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程。凡能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定。传统的毒性测试方法用鱼或原生动物进行试验,费用昂贵且费时较多,用细菌的生长状况或死亡率作为测定环境中毒物的指标,也需要较长时间。利用发光细菌来检测有毒物质,由于有毒物质仅干扰发光细菌的发光系统,费时较少且灵敏度高,操作简便,结果准确,所以利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质,在国内外越来越受到重视。吴自荣等[6]利用发光细菌快速分析大气污染;张秀君等[7]利用发光细菌监测废水的综合毒性;李彬等[8]利用发光细菌诊断重金属污染土壤毒性;Yates 等[9]对黄曲霉素B1、桔霉素等8种霉菌毒素进行了发光细菌分析,结果发现8种毒素的毒性次序与哺乳动物细胞毒性试验结果一致。

利用发光细菌制作生物传感器,是人们研究的热点之一。目前制作生物传感器识别元件的生物材料有酶、菌体细胞、抗原类物质和核酸等,其中纯化的酶类经常用作生物敏感材料。但是纯酶价格很高而且容易失活,难以长期保存及使用,与酶相比,微生物细胞易于制备和保存,而且其中的活性酶类始终保持稳定状态,可以有效延长识别元件的使用寿命。因此,微生物细胞作为制备识别元件的生物材料,具有一定的优势。研究表明,发光细菌的发光强度与某些污染物的浓度呈较好的线性关系,能够稳定、灵敏、快速地反映环境中污染物的浓度变化,因此,利用发光细菌制备识别元件,成为国内外传感器研究和发展的热点。20世纪80年代初美国Beck2 man公司推出功能完备的生物毒性测试仪,它具有应用范围广,灵敏度高,相关性好,反应速度快等优点,发光细菌毒性测试(Luminescent bacteria toxicity test,L.B.T.)技术在世界范围内迅速推广。黄正等[10,11]利用发光细菌作为生物敏感材料,研制了用于污染物毒性监测的传感器,并且进行了环境中有毒污染物的快速检测。Alison M.Horsburgh等[12]利用基于发光细菌的生物传感器对水环境中的工业污染物进行了检测。随着科技的进步,L.B.T.技术与其他分析技术联合应用,扩大了应用范围,取得了很多成果。黄正等[13]将L.B.T.技术与Ames致突变试验、色谱/质谱分析方法结合起来,分析了武汉市工业废水的急性毒性、遗传毒性和主要毒物。

近年来,利用发光细菌毒性试验检测环境污染物急性毒性备受重视,我国于1995年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法(G B/T1544121995)。相信这一技术会在我国的环保事业中发挥更大的作用。

3.2　发光基因的应用

3.2.1　发光基因的组成

发光基因(l ux gene)系统中包括结构基因l ux C,D,A,B,E和调节基因l ux I和l ux R等。从不同发光细菌中分离得到的发光基因其种类和数量有所差异,例如l ux F仅发现于明亮发光杆菌,但以上五个结构基因l ux C,D,A,B,E是普遍存在于已知的所有发光细菌中的。编码菌荧光素酶的基因是l uxA和l uxB,在l ux操纵子中,l uxA和l uxB是紧密相连的。以哈维氏弧菌(V ibrio harveyi)为例,其l uxA基因中含有1065bp,编码的α亚基是355个氨基酸的多肽,分子量为40kD;l uxB基因中含有972bp,编码的β亚基是有324个氨基酸的多肽,分子量为36kD。由α、β两亚基组成的荧光酶的分子量为76kD。编码脂肪酸还原酶(多肽转移酶和还原酶)的l ux C和l uxD位于l uxA、l uxB基因的上游一侧,编码合成酶的l ux E基因位于l uxA,l uxB基因的下游一侧。l ux C含有1431bp,编码的蛋白质含有477个氨基酸,分子量为55kD;l uxD编码的蛋白质分子量为33kD;l ux E编码的蛋白质分子量为42kD。在明亮发光杆菌中还发现有l ux F基因,