酒精醋发酵培养基的优化

表 4 Y2 方差分析表
自由度 K =1 N －1 －K =8 N －1 =9
均方 U / K = 1. 51 Q / （ N － 1 － K） = 0. 113
均方比 F = 13. 29
样本容量 N = 10，显著性水平 α = 0. 05，检验值
Ft = 13. 29，临 界 值 F（ 0. 05，1，8） = 5. 318，复 相 关 系 数 R = 0. 7900。
液体种子。取斜面生长良好的菌种接入装有种 子培养基的三角瓶中，250 mL 三 角 瓶 中 装 50 mL， 30℃ 、150r / min 振荡培养 24 h。
摇瓶发酵。将生长良好的种子接入装有发酵培 养基的三角瓶中，500 mL 三角瓶中装液 50 mL，接种 量 10% ，在 30℃ 、150r / min 振荡培养 36 h。
90 2010 Vol. 36 No. 8 （ Total 272）
生产与科研经验
样本容量 N = 10，显著性水平 α = 0. 05，检验值 Ft = 65. 91，临界值 F（ 0. 05，2，7） = 4. 737，复相关系
数 R = 0. 974 5。
变异来源 回归 剩余 总和
平方和 U = 1. 51 Q = 0. 907 L = 2. 41
液体深层醋酸发酵采用纯种发酵，周期短，产酸 高，生产能力强，因为优势显著而逐渐被国内生产厂 家所采用［3 － 4］。国内以米酒醪进行发酵，平均生产强 度为 1. 5 g / （ L·h） ，国外液态发酵醋多是以食用酒 精为主要底物并添加一定量营养补充剂，平均生产强 度为 2. 0 g / （ L·h） 。随着醋酸用途越来越广和需求 量的攀升，以及国家代粮发酵政策，酒精醋发酵是一 个值得研究的方向。本文在预试验基础上将均匀实 验设计方法应用于酒精醋发酵培养基的优化，通过优 化使醋酸杆菌的菌体量、产酸量达到生产所需，对于 酒精醋生产有指导意义。
① 表 4。
表 3 Y1 方差分析表
变异来源 回归 剩余 总和
平方和 U = 0. 126 Q = 6. 67e － 3 L = 0. 132
自由度 K =2 N －1 －K =7 N －1 =9
均方 U / K = 6. 28e － 2 Q / （ N － 1 － K） = 9. 53e － 4
均方比 F = 65. 91
始 pH 值为 6. 5，温度 30℃，速率 150 r / min 摇床条件下 培养 1 d 后测定菌体干重和醋酸浓度。理论菌体干重为 0. 382 g / L，产酸量为 31. 1 g / L，通过验证实验，实测值分 别为 0. 36 g / L 和 33. 5 g / L，说明所建的回归模型是合适 的，能够为发酵培养基提供理论指导。 2. 3 分批发酵
维持菌体催化活性，葡萄糖主要作为速效性碳源而跟
产酸没有直接关系。
醋酸杆菌产酸为生长偶联型发酵，本实验用菌每
克干菌体大约产生 80 g 醋酸，因此建立菌体干重与
醋酸含量的关系式：
8 Y1 = Y2
③
联立①、②、③： 0. 17 x1 + 0. 3 x2 = 1. 78
④
酵母粉是发酵过程中的关键物质，但市场价格较高
1. 1. 2 培养基 试管斜面培养基（ g / L） ： 葡萄糖 10，酵母浸出粉
10，无水 CaCO3 15，琼脂 20，pH 值 6. 5，121℃ 灭菌 20 min，冷却至 60 ℃ 以下再加无水乙醇 3. 5% （ v / v） 。
液体种子培养基（ g / L） ： 葡萄糖 10，酵母浸出粉 5，pH 值 6. 5，121℃ 灭菌 20 min，冷却至 60 ℃ 以下再 加入无水乙醇 4% （ v /v） 。
酸碱滴定法［5］。 1. 2. 3 酒精检测
气相色谱法［6］。 1. 2. 4 均匀设计实验及验证实验
我国目前还没有成熟的酒精醋发酵工艺，相应的 也没有生产用培养基。在预实验确定最佳培养基成 分的基础上采用均匀设计实验用于酒精醋发酵培养 基成分的优化，实验数据采用均匀设计软件 V3. 0 进 行逐步回归分析建立回归方程［7］。根据回归方程和 国外实际生产情况得到优化的酒精醋发酵培养基，同 时对其进行摇瓶验证和上罐分批发酵实验。
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌种
沪酿 1. 01（ Acetobacter pasteurianus） ： 由徐州恒顺 万通食品酿造有限公司提供。
第一作者： 博士，副教授。 * 国家“863 计划”项目 （ 2006AA10Z314 ） ，国家科技支撑计划重
点项目资助课题（ 2008BAI63B06） 收稿日期： 2010 － 01 － 20，改回日期： 2010 － 05 － 07
2 结果与分析
根据预实验选取葡萄糖、酵母浸出粉、NaH2 PO4 、
KH2 PO4 、MgSO4 ，5 个因素（ 以 g / L 计） 作为培养基的
主要成分，分别设为自变量 X1 、X2 、X3 、X4 、X5 ，菌体干
重（ g / L） 和醋酸产量（ g /100 mL） 分别为因变量 Y1 、
Y2 ，做 5 因素 10 水平均匀设计，各因素及水平列于表
使用优化发酵培养基，用全自动 5L 发酵罐进行 醋酸分批发酵，发酵过程见图 1 和图 2。
表 1 U10 （ 105 ） 实验因素及水平表
葡萄糖 酵母粉 KH2 PO4
（ X1 ） （ X2 ）
（ X3 ）
1
0. 5
0. 5
0. 1
2
1. 0
1. 0
0. 2
3
1. 5
1. 5
0. 3
4
2. 0
2. 0
0. 4
5
2. 5
2. 5
0. 5
6
3. 0
3. 0
0. 6
7
3. 5
3. 5
0. 7
8
发酵培养 基 （ g / L） ： 葡 萄 糖 10，酵 母 浸 出 粉 2， KH2 PO4 0. 2，NaH2 PO4 0. 2，MgSO4 0. 2，pH 值 6. 5， 121℃ 灭菌 20 min，冷却至 60 ℃ 以下加入无水乙醇 5 % （ v /v） 。
发酵优化培养基： 根据实验方案具体配置。 1. 1. 3 主要仪器
冷冻高速离心机，Sigma 公司； 超净台，苏州净化 设备有限公司； UV-2100 分光光度计，尤尼柯仪器有 限公司； BIOFLO110 发酵罐，美国 NBS 公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 培养方法
种子活化。将 2 ～ 4℃ 下保藏的醋酸菌，在无菌 条件下接入试管斜面，于 30℃ 保温培养 48 h，备用。
而不宜大量使用，同时醋酸发酵并不是菌体浓度越高越
好，以达到发酵所需量为宜。根据预实验以及国外实际
生产情况并结合④式得到优化培养基组成，表 5 所示。
表 5 优化培养基组成
优化培养基 / （ g·L － 1 ）
葡萄糖 酵母粉 KH2 PO4 NaH2 PO4 MgSO4
5
3
0. 6
0. 7
0. 4
2. 2 摇瓶验证 根据表 5 得到的优化培养基，在接种量为 10% ，初
4. 0
4. 0
0. 8
9
4. 5
4. 5
0. 9
10
5. 0
5. 0
1. 0
NaH2 PO4 （ X4 ） 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 0. 6 0. 7 0. 8 0. 9 1. 0
MgSO4 （ X5 ） 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 0. 6 0. 7 0. 8 0. 9 1. 0
0. 4
0. 39
3. 68
0. 2
0. 43
3. 48
根据上述实验设计方法所得的结果，采用逐步归分
Y2 = 2. 3 + 0. 27X2
②
析得到菌体干重（ Y1） 和醋酸浓度（ Y2） 的回归方程分别为：
对回归方程进行显著性检验，分析结果分别为表 3、
Y1 = 0. 069 + 0. 02X1 + 0. 071X2
分割发酵： 当醋酸发酵成熟时取出一定量成熟醋 醪，再补加等量的酒醪继续发酵，如此重复发酵。具体 操作： （ 1） 罐温维持在 30℃ ，通气量为 0. 6L / min。（ 2） 酸度 5% （ m / v） 以下时，3 h 测酸 1 次，5% 以上时 1 h 测定 1 次。（ 3） 当发酵酸度超过 6% 时，取出总发酵体 积 33% 的成熟醋醪后再补入等体积酒醪进行发酵。 1. 2. 2 醋酸检测
由回归方程方差分析表可知方程 Y1 、Y2 的 Ft 值 大于各自临界值 F0. 05 并且复相关系数都很合理，说 明方程拟合很好有显著意义。方程 Y1 反映出葡萄糖 和酵母粉是影响菌体量的主要因素，其中 x2 项对方 程的回归贡献为 80% （ 以偏回归平方和计） 。Y2 只 有 x2 项，说明酵母粉是醋酸发酵限制因素。可能因 为酵母粉中含有丰富的生长因子有利于菌体生长和
5L 发酵罐中分批发酵。取生长成熟的二级种子 按发酵罐起始工作体积的 10% 接种（ 罐中的工作体
2010 年第 36 卷第 8 期（ 总第 272 期） 89
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
积为 3 L） ，初始醪的酸度为 11. 8 g / L，酒度为 40. 3 g / L。相关参数控制如下： （ 1） 通气及转速。空气流速 0. 6 L / min，最低搅拌转速为 200 r / min。分批阶段控 制溶解氧在 10% ，发酵罐提高或降低转速自动控制。 （ 2） 温度维持在 30℃ ，自动控制。
2. 1 均匀设计实验
实验号
X1
1
0. 5
2
1
3
1. 5
4
2
5
2. 5
6
3
7
3. 5
8
4
9
4. 5
10
5
表 2 U10 （ 105 ） 实验结果
因素水平
X2
X3
X4
1. 5
0. 4
0. 5
3
0. 8
1. 0
4. 5
0. 1
0. 4
0. 5
0. 5
0. 9
2
0. 9
0. 3
3. 5
0. 2
0. 8
5
0. 6
醋酸杆菌是严格好氧的革兰氏阴性耐醋酸菌，它 通过细胞膜上的脱氢酶系不完全氧化乙醇生成醋酸。 因其产酸稳定，氧化酒精速度快，能力强，在我国食醋 酿造上被广泛应用。本实验用菌为沪酿 1. 01，最高 耐酒精度达 12% ，液态深层发酵过程中单位湿菌体 产酸量一般可达 15. 21 g （ 醋酸） ［1 － 2］，折合约 76 g （ 醋酸） / g（ 干菌体） （ 以 80% 含水量计） 。
生产与科研经验
酒精醋发酵培养基的优化*
杨海麟1 ，亓正良1 ，张玲1 ，王武1 ，冷云伟2 ，权武3
1（ 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122） 2（ 中国矿业大学，江苏 徐州，221008） 3（ 徐州恒顺万通食品酿造公司，江苏 徐州，221003）
摘 要 以探索酒精醋发酵工艺为目的，采用均匀设计方法综合考察葡萄糖、酵母粉、NaH2 PO4 、KH2 PO4 、MgSO4 五种培养基成分对醋酸杆菌发酵过程中菌体量和产酸的影响。根据多元线性回归方程并结合生产实际得出优 化培养基组成为： 葡萄糖 5 g / L、酵母粉 3 g / L、NaH2 PO4 0. 7 g / L、KH2 PO4 0. 6 g / L、MgSO4 0. 4 g / L，验证实验的验 证值与预测值之间吻合较好。5 L 发酵罐中进行发酵研究，分批发酵 25 h 后获得菌体量为 0. 42 g / L，酸度达到 57. 6 g / L，在分批发酵基础上能连续分割发酵，乙醇转化率为 95% ，生产强度达到 2. 0 g / （ L·h） ，相对国内生产 水平提高 33% ，达到国际上酒精醋生产水平。 关键词 醋酸杆菌，酒精醋发酵，培养基优化，均匀设计
1。根据表 1 的因素及水平依据使用规定［8 － 9］选用均
匀设计表，实验设计及结果如表 2 所示。
设实验考察目标的方程模型为多元线性回归方
程：
Yi = b0 + Σ bi Xi
式中： Xi、Yi 分别代表培养基成分和相应的考察
目标； b0 为回归常数项； b1 ，b2 … b5 等分别为待估参
数，显著性水平 α = 0. 05。
0. 2
1
1
0. 7
2.பைடு நூலகம்5
0. 3
0. 1
4
0. 7
0. 6
实验结果
X5
Y1
Y2
0. 9
0. 19
2. 44
0. 7
0. 32
3. 38
0. 5
0. 43
3. 36
0. 3
0. 1
2. 24
0. 1
0. 27
2. 61
1. 0
0. 39
3. 29
0. 8
0. 47
3. 42
0. 6
0. 23
2. 7