转基因水稻讲义

前言：水稻是三大粮食作物之一，世界上近一半人口，都以水稻为主食，它是人类营养和能量摄入最重要的谷物，提供全世界五分之一以上热量消耗。

概况：早在上世纪八十年代早期国际水稻生物技术的研发就在洛克斐勒基金的资助下开展。至今在水稻生物技术方面的专利超过三百项，涉及四百多个组织和机构。从1993年起，在美洲、欧洲、亚洲和澳洲的许多国家陆续开始了转基因水稻的田间试验。目前，已有6个转基因水稻品种获得了不同的批准认可，涉及种植、食用、饲用、进口和加工等方面。全球已培育出近50个转基因抗虫水稻品系，大部分均已进入田间试验阶段，鉴于其环境安全性及食品安全性，还未进行商业化种植，除了2004年伊朗批准抗虫转基因水稻的商业化种植。国内转基因水稻主要是华中农业大学张启发院士课题组在研究，其研发的抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”于2009年8月获得农业部转基因生物安全证书，但是目前并没有获批进行商业化种植。除抗虫水稻外，一些药用或耐除草剂水稻陆续被批准进口或商业化应用。1998年起，美国批准Ventra Bioscience公司研发的转溶菌酶，乳铁蛋白、人血清白蛋白基因的3个药用转基因水稻的商业化种植。美国批准安万特公司的转bar基因耐除草剂水稻及先正达公司的黄金大米等。

我们组通过上网查找资料、借阅图书馆书籍以及询问老师的方式对转基因水稻有了进一步的了解，现在和大家一起来揭开转基因水稻的神秘面纱。

首先要介绍的是目前人类对转基因水稻研发所能达到的技术水平。

技术比较成熟的有以下四种水稻：

1、抗虫转基因水稻

2、抗除草剂转基因水稻

3、抗花粉过敏转基因水稻

4、金稻

技术还在研发中的水稻主要有抗逆性转基因水稻、高产和优质性状转基因水稻这两种。

表格

接下来介绍转基因水稻的工艺流程。

我们知道，基因工程包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术主要是对外源基因的重组设计，分为以下几步：

1、切（获取目的基因）

2、接（构建基因表达载体）

3、转（将目的基因导入受体细胞）

4、增（扩增DNA重组分子）

5、检（目的基因的检测与表达产物的测定）

每一步具体的操作方法会根据供体、受体细胞的不同而改变，越具体到可以直接指导我们的实际操作的资料信息就越高精尖，目前我们的能力无法理清这些，所以只总结了一般可以选择的几种方法。

第一步获取目的基因主要有三种方法，分别是鸟枪法（即直接分离目的基因）、人工合成法和从文库中获取。

鸟枪法：

cDNA法：将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用反转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体细胞内，通过筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆，这就是cDNA法克隆蛋白质编码基因的基本原理。

化学合成

人工合成法：

聚合酶链式反应（PCR）

化学合成：如果目的基因的全序列是已知的，则可以利用化学合成法直接合成。目前已能利用DNA合成仪自动合成不超过50bp任何特定序列的寡聚核苷酸单链。目的基因的化学合成实质上是双链DNA的合成，可以分别直接合成其两条互补链，然后退火即可。对于大片段目的基因的合成，一次合成收率很低，故通常采用单链小片段DNA模板拼接的方法。

聚合酶链式反应（PCR）：

PCR扩增技术的本质是根据生物体DNA的复制原理在体外合成DNA。包括三步程序：

1、将待扩增双链DNA加热变性，形成单链模板；（94℃）

2、加入两种不同的单链DNA引物，并分别与两条单链DNA模板退火；（50℃）

3、DNA聚合酶从两个引物的3’羟基端按照模板要求合成新生DNA链，构成一轮复制反应。（72℃）

重复上次操作n次，理论上即可从1分子的双链DNA扩增到2的n次方个分子。（实际操作中不止一分子）

从文库中获取：

基因文库是指某一特定生物体全基因组的克隆集合。基因文库的构建就是将生物体的全基因组分成若干DNA片段，分别与载体DNA在体外拼接成重组分子，然后导入受体细胞中，形成一整套含有该生物体全基因组DNA片段的克隆，并将各克隆中的DNA片段按照其在细胞内染色体上的天然序列进行排序和整理，因此某一生物体的基因文库实质上就是一个基因银行。人们既可以通过基因文库的构建储存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，同时又能够在必须时从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。

第二步中，在转基因水稻工艺流程中主要选用农杆菌Ti质粒作为载体。选定载体后要对其进行改造和构建，一般都要删除不必要区域，缩小它的相对分子量，同时采取措施避免它的扩散（对载体进行修饰），并且还要删除重复的酶切位点，加入标记基因等。在外源DNA片段与载体分子剪接前，还需要对连接位点做特殊的技术处理，以提高连接效率，所有这些操作均由一系列功能各异的工具酶来完成，其中一些常用的工具酶本身也已使用基因工程方法产生，如部分的限制性核酸内切酶、T4-DNA连接酶以及Klewnow DNA聚合酶等。最终的重组质粒的T-DNA区（即目的片段）包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS 报告基因、抗性基因。

第三步中，以经过改造的农杆菌Ti质粒为载体，通过寄主感染受体植物的途径将外源基因转入受体细胞。Ps:利用农杆菌感染植物细胞主要是依据它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位的性质（受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞），然而起初这种方法只被用于双子叶植物中，这是因为单子叶植物如水稻，对农杆菌并不敏感，因此，利用它感染水稻时，我们要人为添加乙酰丁香酮，驱使农杆菌移向受伤细胞。通常选用叶盘法进行转化。

第四步就是短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子使其整合到受体细胞的基因组中。

第五步，是筛选和鉴定经转化处理的细胞，跟踪目的基因在转基因植物中的行为。主要是对报告基因、外源DNA及其在转录水平上的表达、外源表达蛋白的检测。报告基因由于其表达产物易于检测，在这里不赘述。

对外源DNA的检测：

点杂交、Southern杂交和PCR鉴定法

点杂交是将提取DNA或RNA不经酶切,直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与探针进行杂交的技术。利用点杂交,可以初步鉴定转化体中是否有整和的外源基因。罗云波用DNA、RNA的点