枸杞多糖提取工艺比较及体外抗氧化性研究

不同工艺的枸杞多糖提取率比较及其体外抗氧化性研究

枸杞多糖是一种优质的水溶性植物多糖，提取自宁夏枸杞的果实。现代药理研究已表明，枸杞多糖能够改善老年人易疲劳、食欲不振、视力模糊等症状，同时还是枸杞子中调节人体免疫、延缓衰老的主要活性成分。

枸杞多糖作为西安源森生物公司的主打产品，已被广泛应用于食品饮料以及保健品领域。为向客户提供更高品质的产品，日前，西安源森生物实验室就枸杞多糖的不同提取工艺进行对比研究，并对枸杞多糖体外抗氧化性进行了测定。

实验概述: 1. 西安源森生物实验室分别用三种提取方法：浸泡提取法、超声波提取法和微波提取法提取枸杞多糖；然后采用硫酸- 苯酚法对多糖含量进行定性定量分析，得出不同提取方法所得的枸杞多糖含量及提取率；

2. 根据枸杞粗多糖对自由基的清除率以及对超氧阴离子的清除作用的测定，比较同浓度条件下的VC 与枸杞多糖对抗氧化活性。枸杞多糖体外抗氧化性结论。

一、三种提取方法提取枸杞多糖的提取率研究

（一）实验材料与试剂

1. 材料

宁夏枸杞西安源森生物实验室自产地直接采购；

2. 试剂

（1）5% 苯酚；

（2）8mmol/L HCl；25mmol/L 邻苯三酚溶液；

（3）0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)；10%三氯乙酸；

（4）邻苯三酚(焦性没食子酸，分析纯)；

（5）三羟基甲基氨基甲烷(Tris)(分析纯)；

（6）1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl, DPPH)。

（二）仪器与设备

（1）索氏提取装置，HH-S 数显恒温水浴锅；

（2）YHW-102 型远红外干燥箱；

（3）KQ3200 型超声波清洗仪；

（4）WFJ-7200 型可见光分光光度计；

（5）LDZ5-2 低速自动平衡离心机；

（6）WP700 型微波炉；

（7）TU-1900 双光束紫外可见分光光度计；

（8）DL-1 万用电炉规格(单联电压220V，功率：LX/KW)；

（9）ZDHW 型调温电热套(规格250ml，功率150W)；

（10）JA2003 型电子天平。

（三）实验步骤

1.枸杞预处理

将宁夏枸杞放于60℃恒温箱中恒温干燥24h→称量→剪碎→回流脱脂（回流两次，每次3 h）→弃去溶剂，残渣风干，残渣即为经过预处理的枸杞。

2. 利用三种方法进行枸杞多糖的提取

（1）浸泡法提枸杞多糖

用电子天平称取等量经预处理后的枸杞，浸泡3h，然后用90℃的水浴提取1.5h，用脱脂棉过滤，重复提取3 次，弃去残渣，合并滤液，浓缩，离心(3000r/min，30min)，弃去残

渣，上清液为多糖溶液。

（2）超声波法提取枸杞多糖

用电子天平称取等量经预处理后的枸杞，置超声波清洗仪中，40℃恒温超声波提取1h，脱脂棉过滤，重复提取3 次，弃去残渣，合并滤液，浓缩，离心(3000r/min，30min)，弃去残渣，上清液为多糖溶液。

（3）微波法提取枸杞多糖

用电子天平称取等量经预处理后的枸杞，置于微波炉中加热提取2 0 m i n ，脱脂棉过滤，重复提取3 次，弃去残渣，合并滤液，浓缩，离心(3000r/min，30min)，弃去残渣，上清液为多糖溶液。

3. 三氯乙酸法去除蛋白质

在枸杞多糖水溶液中加入10% 三氯乙酸，调节pH 至3，在10℃条件下放置过夜，离心(3000r/min，30min)，弃去沉淀，即得无蛋白质的多糖溶液（待测样品溶液）。

4. 枸杞多糖沉淀

向除去蛋白质的枸杞多糖溶液中加入4 倍体积的95%乙醇沉淀，静置24h，离心(3000r/min，30min)，弃去上清夜，固态物用9 5 %乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚依次进行洗涤，颜色分别由黄色洗至近无色，后置于6 0 ℃恒温干燥2 4 h ，即为枸杞多糖粗品。

5. 多糖再沉淀

将枸杞多糖粗品溶于热水中使其完全溶解，过滤弃去沉淀，浓缩溶液，向枸杞多糖溶液中加入4 倍体积的95%乙醇沉淀，静置24h。离心(3000r/min，30min)，弃去上清液，固态物用9 5 %乙醇、无水乙醇、丙酮和乙醚依次进行洗涤，颜色洗至近无色，于6 0 ℃恒温干燥2 4 h ，即为枸杞多糖。

（四）标准曲线的绘制

1. 葡萄糖标准溶液配制

2. 标准曲线绘制

编号为1、2、3 、4 、5 、6的具塞试管中为精确量取的标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml。其中，1 号试管为空白对照溶液。

试管中分别加水至2.0ml，分别精确加入5% 苯酚溶液1.0ml（摇匀）→迅速加入浓硫酸5.0ml（摇匀）→放置10min→置40℃水浴中保温15min→取出后迅速冷却至室温。

用紫外-可见分光光度法在490nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y=0.107x+0.1202，r=0.9992(n=5)(图1)。

可以看出，吸光度随着葡萄糖溶液浓度的变化而呈线性变化。用测定得到的吸光度，根据线性回归方程y=0.107x+0.1202 计算多糖溶液中葡萄糖的浓度。

3. 换算因子的测定

精确称取于60℃恒温箱干燥至恒重的、经过再沉淀的枸杞多糖20mg，置于100ml 容量瓶中，用适量蒸馏水水溶解后，定容至刻度线，摇匀，作为枸杞多糖储备液。

精确量取枸杞多糖储备液1.0ml加水至2.0ml，按照标准曲线的绘制方法测定其吸光度。按照下式计算换算因子F 测得F=1.67。

其中，D 为多糖的稀释因素；C 为多糖稀释液中葡萄糖的浓度(mg/ml)；W 为枸杞多糖的质量(mg)。

4. 样品溶液的制备

用电子天平称取经预处理后的枸杞，于回流装置中回流脱脂（两次，每次3 h）→弃去溶剂，残渣风干→以80%乙醇300ml 回流脱单糖两次，每次3h→回收乙醇。

向残渣中加入450ml 蒸馏水，在不同的条件下(浸泡提取、超声波提取、微波提取) 提取( 三次) →过滤→合并滤液→浓缩，离心(3000r/min，30min)→弃去残渣，上清液为多糖水溶液。

再向枸杞多糖水溶液中加入10%三氯乙酸→调节pH至3→静置24h，离心(3000r/min，10min)→弃去沉淀，即为无蛋白质的待测多糖溶液。

（五）枸杞多糖含量测定

精确吸取样品溶液1.0ml→加蒸馏水至2.0ml→再加入1.0ml 5% 苯酚溶液（摇匀）→迅速加入浓硫酸5.0ml（摇匀）→放置10min→置40℃水浴保温15min→迅速冷却至室温。

在紫外-可见分光光度490nm 处测吸光度，按以下公式计算样品溶液中多糖的含量。