中心试验室试验指引-中国医学科学院北京协和医院中心试验室

自动切胶仪

作者：郭丹

修订日期：2014-9-18

【目的及应用】：

Ettan自动切点仪可以与多种凝胶染色方式兼容，包括考马斯亮蓝染色，银染和SYPRO荧光染色等。通过识别两个参照标志物的坐标位置（X和Y）来确定出胶内蛋白点的精确坐标，误差不超过1毫米，一个循环可以切下9600个蛋白胶粒。

【试剂及设备】：

1.1 设备：Ettan Spot Picker自动切胶仪

【实验步骤】：

1.仪器开机系统设置

1.1 仪器开机：按下仪器背部的总开关，系统电源即被接通，进入主界面启动Ettan Spot Picker 控制软件。要求仪器复位的对话框将会出现。点击“OK”。

1.2系统设置：选择“System：System Setup”

推荐在设置任何系统位置前，都先使用“Initialize Instrument”“Go to Home”按钮。“System Setup”屏中可以允许用户设置：

(1) Rinse Station清洗站的位置（XYZ轴，无须每次设置）；

(2) 切胶平面的Pick头高度（Z轴，必须每次设置）；

(3) 96孔板A1孔的位置（XYZ轴，无须每次设置）；

(4) 切胶时所需要的一些参数设置（无须每次设置）。

注：在任何情况下，用户都可以通过点击“Cancel”按钮退出“System Setup”程序。如果选择了“Cancel”，则对“System Setup”进行的所有修改将全部丢失。如果需要保存修改设置，则点击“Save and Exit”。

1.3系统灌注

将缓冲管放在适合切胶的溶液中。在载入切胶列表后，软件将会告知用户切下所有蛋白点所需要的溶液提及。推荐使用双蒸水或者合适的清洗/脱色液作为切胶时的系统缓冲液。

注意：在灌注系统前必须确保系统设置中清洗站的位置已经被正确设置

（1）选择“Tools: Prime Syringe”。

（2）在“Prime Syringe”中，输入清洗次数（推荐为5-10次），按“Prime”键。

（3）可以使用“ Stop”键中止清洗。

（4）清洗结束后，点击“Exit”

2. 放置凝胶

(1)将凝胶盘放于Ettan Spot Picker。

(2)将凝胶放于凝胶盘上，并用少量液体（例如：固定/储存液或双蒸水）覆盖凝胶至约2毫米

厚。如果待切蛋白点数量较多，则需要更多体积的液体以补偿挥发造成的损失。为了避免产生气泡，放置凝胶前需要在胶盘内加入少量液体，然后将凝胶从一侧逐渐倾斜，直至放入胶盘内。

(3)放置凝胶时，要使参照标志位于胶盘中央的平行线内。注意不要使参照标志与平行线相交

或接触，以免影响到参照标志的识别。

(4)将凝胶固定器装在胶盘内的缝隙中，是用凝胶固定器稳固的固定凝胶，用手指转动螺丝将

其固定。

注意：对于面积较大的凝胶，凝胶固定器需要在放置凝胶前就固定在胶盘上。否则，凝胶可能被凝胶固定器破坏。

3. 切胶操作

3.1 载入切点列表

(1)在“Load Pick List”窗口中，选择使用的参照标志类型（黑色/白色），点击“Load Pick List”。

(2)浏览寻找切点列表。

(3)选中切点列表，点击“Open”。

(4)如果使用ImageScanner对凝胶进行扫描，检查“Use Correction”框。在“Scanner Id”列表项中

选择使用的扫描仪，并在“Resolution（DPI）”列表项中选择凝胶扫描时使用的分辨率（300DPI）。

(5)选中“Open”。切点列表数据将会显示于屏幕上，窗口的主要部分将显示出待切蛋白点的图

像和有关信息。X和Y轴坐标列显示为空白，因为参照标志尚未被识别。

(6)在“Load Pick List”窗口中，选择“Next”。

(7)如果微孔板尚未放置，则使用合适的编号标记它们（如图所示），并将前四块（或更少）

微孔板放于自动切点仪的微孔板架上。

(8) 点击“Next”。

3.2识别参照标志

(1) 打开Camera的镜头盖；先使用Auto自动检测Markers，要求Markers位于胶中央Camera

的视野中并且形状完整，Camera能够自动识别并接受Markers，即窗口由红色变为绿色。

(2)当自动检测无法识别Markers，需要Manual手动检测：使用兰色方向箭头移动Camera至

Markers上，使Markers位于视野中央，同时可以通过拖动的“Contrast”和“Threshold”选项调节，直到获得质量较好的图像信息。如果图像清晰度不够，则可以通过调节相机光圈和聚焦，使其在“Camera view”中显示为一个清晰的圆点，直到Camera能够识别并接受Markers。

3.3切胶

(1) 在“Pick Spots”窗口中，点击“Pick”。

(2) 在“Result File Location”窗口中，选择存放切点结果文件的位置。

(3) 输入待输出的文件夹和文件名称。切点结果将会以文件夹的形式存放于所选位置。切点过

程中每块含有胶粒的微孔板（即使是部分）都会以一个单一文件的形式储存。

(4) 点击“Create Directory & Start Picking”。

3.4 重复切点过程

对于切点结果不满意或者切失败的点，可以通过重复该切点过程来完成切点。重复时或许需要调整某些切点参数，例如增加jazz.

(1) 标出微孔板的位置和漏切的蛋白胶粒孔位置。

(2) 在“Load Pick List”窗口内，点击“Load Pick List”。

(3) 寻找已执行的切点程序结果文件（extension.mfl）

(4) 选择结果文件。不要使用修正功能！点击“Open”。

(2)结果表格将会显示在屏幕上。