虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究

虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究
摘要:从中药材虎杖中筛选到一株具有转化虎杖苷能力的根霉菌株T-34,利用该菌株产生
的B-葡萄糖苷酶能将虎杖苷转化为白藜芦醇.虎杖的液体发酵动力学研究结果显示:根霉菌
T-34能够直接利用虎杖煮提液中的碳源、氮源等作为其生长所需的营养,并且产生的B-葡萄糖苷酶与底物虎杖苷的转化具有相对应的关系,用HPLC测得虎杖苷的转化率达98%.
关键词:微生物转化;虎杖;虎杖苷;白藜芦醇;B-葡萄糖苷酶
Biotransformation of polydatin fromPolygonum cuspidatum
byRhizopussp. T-34
Abstract:, isolated by strain-screening test, could transform polydatin into resveratrol
during fermentation ofPolygonum cuspidatumin this experiment. Kinetics of fermentation was studied to
follow the transformation process, and the results suggested could utilize carbon re-
source, nitrogen resource and etc directly as its nutrition, furthermore,B-glucosidase produced by the strain
was correspondingly related to the transformation of polydatin, and the transformation rate of polydatin could
reach 98%.
Key words:microbial transformation,Polygonum cuspidatum,polydatin, resveratrol,B-glucosidase
1 引言
虎杖始载于5名医别录6,为蓼科植物虎杖的干
燥根茎,主要有效成分为二苯乙烯类和蒽醌类化合
物,前者包括白藜芦醇及其糖苷[1].据报道白藜芦
醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过
敏、抗动脉粥样硬化和具有冠心病、缺血性心脏病、
高血脂症的防治作用,白藜芦醇已被列为抗心血
管、抗癌最有前途的药物之一[2].干燥虎杖根茎中
白藜芦醇含量仅为%~% ,而虎杖苷含量
约为2%左右[3],虎杖苷可在肠道中被糖苷酶分解
释放出白藜芦醇,发挥其药理作用[4].目前有研究
用酸水解法对虎杖苷进行分解[5],但是酸碱会造
成环境污染,降低产量,因此不宜用化学法进行水
解.也有用改性纤维素酶直接对虎杖苷进行分
解[6],但成本较高、工艺较为复杂,不利于推广应
用.本项研究采用微生物发酵法转化虎杖苷,即没
有强烈的酸碱反应发生,又无需粗提苷,有效的避
免了上述两种方法存在的缺陷.因此利用专一微
生物进行发酵是提高虎杖中白藜芦醇含量的有效
2008年4月
第45卷第2期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition) Apr. 2008
途径之一.
2 材料和方法
材料
2.1.1 仪器和试剂虎杖购于成都同仁堂药房,
并经成都中医药大学药用植物鉴定室鉴定为蓼科
植物虎杖的根茎.白藜芦醇标准品(购于成都思科
华有限责任公司),高效液相色谱仪(美国Waters
公司),Tu-1800紫外可见分光光度计(北京普析通
用仪器有限责任公司),GBRT全自控10L发酵罐
(烟台高新区海洋生物工程研究所).
2.1.2 培养基初筛平板:主要成分为%
NaNO3, 0. 1% K2HPO4, 0. 05% KCl, 0. 05%
MgSO4, % FeSO4, 1%虎杖苷.
发酵培养基(复筛培养基):主要成分为虎杖
煮提液.
方法
2.2.1 菌种的筛选取自然长菌的虎杖粉1 g,加
入20 mL的无菌水,摇匀,静置片刻,取上清液
mL梯度稀释,各吸取 mL于初筛平板上按常
规涂布方法30e培养3~4 d,挑选长势良好的单
菌落,得到青霉,黄曲霉,木霉,根霉等四十株菌种,
保藏待用.将初筛菌种接入复筛培养基中,32e,
170 r/min摇床中发酵3 和HPLC法检测
发酵产物.
2.2.2 TLC检测法见文献[7] .
2.2.3 HPLC检测法高效液相色谱仪测定白藜
芦醇和虎杖苷的色谱分析条件:色谱柱C18柱
(416@150 mm);柱温25e;流动相是甲醇:水为
40B60;流速1 mL/min,进样量20LL;检测波长
305 nm.根据标准样的峰面积和进样浓度作回归
曲线,白藜芦醇的回归方程为y=@108x+
1121@104,相关系数R=,在20@10-6g/
mL~100@10-6g/mL范围内和峰面积成线性关
系;虎杖苷的回归方程为y=
@105,相关系数R=,在20@10-6g/mL~
100@10-6g/mL范围内和峰面积成线性关系.
2.2.4 发酵动力学研究采用GBRT全自控发
酵罐10 L进行发酵罐培养,发酵罐装培养液量为
8 L,接种量为5%,孢子悬液浓度为?
@108cfu/mL,发酵温度为32e,转速为300 r/
min,通气量为0.06 m3/h,初始pH为,发酵周
期132 h.发酵动力学的研究内容包括了菌体生长
量,碳源,氮源,酶活,pH,苷和苷元变化.菌体生长
量的测定方法采取细胞干重法;多糖的测定方法用
苯酚硫酸法进行测定;还原糖的测定法是用DNS
法进行测定;总蛋白的测定方法是凯氏定氮法;用
PNPG作底物进行B-葡萄糖苷酶酶活的测定[8];
溶氧采用GBPT全自控发酵罐溶氧测定仪测定;
发酵罐在线检测pH值;苷和苷元的检测方法如
21213所述.
3 结果与分析
菌种的筛选
将初筛保存的40株菌种分别接种虎杖煮提液
(复筛培养基),32e,170 r/min摇床中发酵3 d,
发酵液作产物TLC检测,结果如下.
表1 转化虎杖苷的菌种筛选
Screen microorganisms for biotransformation
of polydatin
菌种虎杖苷白藜芦醇
空白对照CK + -
青霉Penicillium chrysogenum+ +
黄曲霉Aspergillus flavus+ -
黑曲霉Aspergillus niger+ +
木霉Trichodermasp - -
根霉T-7Rhizopussp T-7 + -
根霉T-13Rhizopussp T-13 + +
根霉T-16Rhizopussp T-16 + +
根霉T-26Rhizopussp T-26 + +
根霉T-34Rhizopussp T-34 - +
根霉T-38Rhizopussp T-38 + +
+: TLC上检测到明显的物质;-: TLC上未检测到明显的物质由表1结果可以看出,其中根霉T-34菌种的
虎杖发酵液的TLC结果表明虎杖苷斑点完全消
失,白藜芦醇斑点加深明显,此菌株即为目标菌株,
该菌株与虎杖共发酵能成功将虎杖苷转化为白藜
芦醇.
发酵产物的HPLC检测
在所述发酵条件下进行液体发酵,并采用
HPLC法对发酵转化产物进一步检测.图1为虎杖
苷转化产物的HPLC检测结果.对比色谱图Ñ,
Ò,可以看出保留时间 min虎杖苷的吸收峰
完全消失,保留时间 min白藜芦醇的吸收
峰增加明显,这充分证明了该根霉菌与虎杖的共发
酵达到了完全转化虎杖苷的目的,生成了目标物白
藜芦醇.
438四川大学学报(自然科学版)第45卷图1 虎杖苷转化产物的HPLC分析 HPLC analysis of transformation product of Polydatin
Ñ发酵前的虎杖提取液(10 g/L);Ò发酵后的虎杖提取液(10 g/L )
发酵动力学的研究
在2.2.4的发酵罐培养条件下进行发酵,每隔
一段时间取样,研究发酵过程中菌体量、总糖(多糖
和还原糖)、总蛋白、苷和苷元、酶活、溶解氧、pH的
变化.进一步揭示了根霉T-34转化虎杖苷的发酵
机理,也为该菌种的实际应用提供了参考数据:产
物白藜芦醇的积累与酶活密切相关,与菌体生长直
接偶联;菌体生长过程中消耗了大量的碳氮源,36
h菌体生长进入稳定期,虎杖苷转化为白藜芦醇也
在36 h基本完成.这预示着生产过程中若要连续
培养,36 h是最佳的补料时间.
3.3.1 菌体的生长动力学由图2可知:在整个
发酵周期中,碳氮比例变化范围为~,此碳
氮比例能满足根霉菌种的生长.在36 h前,总糖
(还原糖和多糖)和总蛋白都迅速降低,为菌体的大
量生成提供丰富的碳源和氮源.36 h后随着菌体
量达到最大,碳源和氮源的消耗速度大幅度的减
缓;其中还原糖有缓慢增加的趋势,可能的原因是
稳定期中微生物产生了多种酶类如糖化酶、纤维素
酶等,这些酶水解淀粉、纤维素等又产生了少量还
原糖.
3.3.2 菌体量、pH和溶解氧的动力学曲线由图
3可知:发酵过程中随着菌体量的增加,溶液的pH
由下降到,可能的原因是根霉菌生长能够
利用碳源产生了少量有机酸;36 h以后pH变化趋
于平缓,92 h后又有所下降;发酵过程中,溶解氧
由100%下降到80%,是由于发酵罐中高速的搅拌
速度和较高的通风量使溶氧量维持在较高水平.
图2 菌体量,还原糖,多糖以及
总蛋白的动力学曲线
Kinetic curves of biomass, reducing sugar,
amylase and total protein
3.3.3 酶和底物、产物的动力学曲线由图4可
知:24 h前虎杖苷和白藜芦醇的变化不明显,24~
36 h,由于B-葡萄糖苷酶的水解作用,虎杖苷由
0153 g/L迅速降低直至转化完全,白藜芦醇由
0104 g/L迅速增加到最大量0.332 g/L,36 h以后
白藜芦醇的量逐步减少.从酶活曲线可见,B-葡萄
糖苷酶酶活从12 h开始增加,36 h酶活基本达最
大值 U/mL,36 h后酶活缓慢降低.由此可见
酶活的变化趋势和底物虎杖苷的转化是相对应的.
另外要指出的是白藜芦醇的分子量228,虎杖苷分
子量408,根据该图中虎杖苷的最大量和白藜芦醇
的增加量计算出虎杖苷转化为白藜芦醇的转化率
可达98%.
439第2期田天丽等:虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究图3 菌体量、pH和溶解氧的动力学曲线
Kinetic curves of biomass, pH value
and dissolved oxygen
图4 虎杖苷,白藜芦醇以及B-葡萄糖苷
酶酶活的动力学曲线
Kinetic curves of polydatin , resveratrol,
andB-glucosidase activity
4 讨论
微生物有着非常强大的分解转化物质的能力,
并能产生丰富的酶系,这些丰富而强大的酶系就可
能成为中药化学成分在较温和的条件下催化化学
反应的物质基础,也就是微生物可以用来发酵转化
中药的理论根据[9].本文在此理论基础上对中药
虎杖进行微生物的发酵转化,培养基直接采用中药
虎杖,不需添加其他成分,发酵条件易控制,且虎杖
苷成分转化效率高.通过微生物发酵转化虎杖,一
方面提高虎杖中苷元含量,可获得高产苷元提取
物;另一方面,有利于中药材虎杖资源的开发和利
用.本文建立筛菌模型,对转化虎杖的B-葡萄糖苷
酶产生菌进行筛选,具有特异性高,快速简便的优
点,筛选到的一株具有转化虎杖中虎杖苷的根霉菌
种T-34.通过对发酵产物的TLC、HPLC分析,证
实了这株菌种能够转化虎杖苷,并且转化效率达
98%以上,从而将虎杖中白藜芦醇含量提高到相当
水平.通过研究发酵罐条件下微生物转化虎杖的发
酵动力学,证明了该根霉菌能直接利用中药中的碳
氮源生长,产生的B-葡萄糖苷酶也能高效水解虎
杖苷为白藜芦醇;有关发酵动力学研究所阐述的多
种因素的变化和目标产物的变化,提示我们可以通
过对培养条件进一步优化,缩短发酵时间使酶活能
够更快的达到最高,使得培养条件更加适合虎杖苷
的转化,更好的引导实际的中试发酵和生产.
参考文献:
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[责任编辑:白林含]
440四川大学学报(自然科学版)第45卷。