应用培训_Operetta高内涵筛选系统

间充质干细胞 (MSCs)成脂分化
0 µM insulin
1.74 µM insulin
10 µM insulin
MSCs were cultured in adipocyte differentiation medium with different insulin concentrations Staining: DAPI (nuclei, blue), TRITC-phalloidin (actin, yellow), LipidTOX™ (lipid droplets, green) Images acquired on the Operetta® system using 20x high NA objective, non-confocal
鉴定、分离并检测不同细胞群体的分类 分析。
4
高内涵能做什么？
5
预设分析方案，方便应用
6
细胞凋亡
Nuclear fragmentation Caspase-3 activation
Cell seeding
Compound addition
Fixation & staining
Readout
Equilibration 16 h
刺激30min后，核内p65-HT百分比 达到最高值
22
Live cell imaging allows the study of signaling dynamics
胞内p65 分布具有剂量依赖性
分析TNF刺激30 min 后，p65-HT分布的剂量依赖性
1.05
1.05
(nucleus/cytoplasm)
U2OS cells expressing tagged endothelin（内皮素）A receptor, dose-response curves for Endothelin 1 and Sarafatoxin 6b
0.8
Endothelin-1 Sarafotoxin-6b
Rel. number of cells showing translocation
23
Quantitative analysis yields excellent Z’ values ≥ 0.7
间充质干细胞成脂分化
Data generated in the PerkinElmer Application Lab, Hamburg
24
© 2012 2009 PerkinElmer
Operetta高内涵筛选系统 应用培训
黄 晔 2014.3
1
U2OS（人骨肉瘤）cells expressing tagged endothelin（内皮素）A receptor, dose-response curves for Endothelin 1 and Sarafatoxin 6b
2
9
细胞周期
Cell seeding
Compound addition Incubation 18 h
Fixation and staining
Readout
Equilibration 24 h
Labeling
3h
Imaging
10
细胞周期检测- 成像
Control
False color overlay of Hoechst 33342, Alexa Fluor® 488 and Alexa Fluor® 647 channel
Anti EdU antibody, labeled with Alexa Fluor® 488 HOECHST 33342, combined with CellMask Blue
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细胞周期检测结果 I – DNA 含量分布
G1
G2/M
根据核染色平均荧光强度和总荧 光强度做聚类分析散点图 S-phase 细胞核平均荧光强度几乎 没有变化，而面积增大 M-phase 和 early G1-phase细胞和面 积变小，荧光强度增大 2N DNA (G1-phase) 和4N DNA (G2/M-phase) 能很明显地区分开
20x long WD 物镜成像 对HepG2细胞进行3种化合物处理 (Carbonyl Cyanide P-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone , Tacrine and Acetaminophen) ，观察到细胞毒性 处理后细胞数量减少，质膜透性增பைடு நூலகம்，线粒体数量增多，细胞核变小
13
细胞毒性检测
mitochondrial mass nuclear area
Cell seeding
Compound addition Incubation 24 h
Live cell staining Labeling 40 min
Readout
Equilibration 24 h
Imaging
0.6 0.4
0.2
0.0 -10 10
10
-9
10 10 Agonist [M]
-8
-7
10
-6
10
-5
3
什么是高内涵分析
高内涵细胞分析技术是全自动、高 通量荧光显微成像结合多参数定量 分析的技术，在单次细胞实验中可 获得大量数据，包括：
细胞中靶标分子的空间分布；
单个细胞或细胞群体荧光强度、形态学 以及细胞纹理学等多参数定量分析；
S
2N 4N
12
细胞周期检测结果II
Dose-response curves for Thymidine (left) and Nocodazole (right) effects on cell cycle phases. S-phase cells (EdU positive) are shown in green, M-phase cells (pHH3 positive ) in red, G1cells in gray and G2-cells in orange (both based on DNA intensity) Thymidine（胸腺嘧啶）诱导细胞停滞在 G1-phase Nocodazole （诺考达唑） 促进细胞进入M-phase
20x long WD 物镜成像 增加星孢菌素浓导致caspase-3 浓度增 加 药物处理后的细胞核表现出典型的凋 亡现象，核皱缩，面积变小，亮度增 加；在凋亡晚期细胞核碎片化
30 µ M Staurosporine
8
凋亡检测—结果
Caspase-3 based readout (left) and nuclear morphology based readout (right) show similar EC50 values for staurosporine.
Incubation 4h
Assay
7
凋亡检测 – 成像
Caspase 3 活化 细胞计数 细胞核大小 细胞核碎片化 Alexa Fluor® 488 labeled anti caspase-3 antibody DRAQ5™ DRAQ5™ DRAQ5™
3 µ M Staurosporine Control
Nuclear Intensity
Nuclear Area [祄 2]
200
150
10000 8000 6000
100
50 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 Log compound [礛 ] AAP Tacrine FCCP 17.2 礛 240.8 礛 34.2 mM
4000 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 Log compound [礛 ] Tacrine AAP FCCP 13.8 礛 317.6 礛 31.1 mM
7000 6000
Mitochondrial Mass
5000 4000 3000 2000 -3 -2 0 1 2 3 4 Log compound [礛 ] AAP Tacrine FCCP 5.2 礛 117.7 礛 n/a -1 5 6
EC50
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细胞毒性检测结果IV - 细胞膜透性
通过不能透过细胞 膜的BOBO™-3染色 定量分析细胞膜受 损伤程度. 细胞毒作用后期， 细胞膜完整性降 低，因此根据 BOBO™-3 染色读数 计算的EC50 值高于 其它方法得到的 EC50
NF-B转位具有时间效应
通过Harmony® 高内涵成像和分析软件计算 计算NF-B荧光 信号的核质比
1.05
(nucleus/cytoplasm)
C
A
B
ratio TMR
0.95
A
B
0.85
C
0.75 -50
0 0 ng/ml TNF
50
100
150
time[min]
10 ng/ml TNF
15
细胞毒性检测结果I- Cell Count
Cell count is a very sensitive indicator of cytotoxicity (very low EC50 values, compared to other methods)
2750 2500 2250 2000
Cell Count
100
Membrane Permeability [%]
80 60 40 20 0 -3 -2 -1 FCCP 35.4 µ M 0 1 2 3 4 5 6 Log compound [µ M]
EC50
Tacrine 345.3 µ M
AAP 49.1 mM
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在活细胞内分析NF-B 动 态变化
(nucleus/cytoplasm)
ratio TMR
ratio TMR
-1 0 1 2
0.95
0.95
0.85
0.85
0.75 -2
Log TNF [ng/ml]
0.75 TNF [ng/ml] Ro106-9920[ M]
10 0.0
10 0.8
10 5.0
0 0.0
核内NF-B信号随TNF浓度的增加而增加 (EC50 = 0.5 ng/ml) 进入核内的NF-B随Ro106-9920（稳定抑制NF-B信号）浓度的增加而降低，具有 剂量依赖性 通过活细胞的方法检测化合物对NFB入核或出核的动态变化进行检测
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© 2012 2009 PerkinElmer
HaloTag® TMR ligand染活细胞
HaloTag® TMR ligand (fused to p65 subunit of NF-B); 30 min post-TNF addition
0 ng/ml TNF
0.5 ng/ml TNF
30 µ M Thymidine
1 µ M Nocodazole
Cell cycle phases for individual cells
Mitotic index
S-phase DNA content
Anti phosphohistone H3 antibody, labeled with Alexa Fluor® 647
EC50
EC50
细胞损伤后通常会造成细胞核皱缩 FCCP 和 Tacrine 导致细胞核皱缩，同时细胞核荧光强增大 AAP 最初导致细胞核增大，很可能是因为诱导细胞坏死，然后细胞核皱 缩
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细胞毒性检测结果III – 线粒体数量
线粒体在细胞毒作用 早期就受到影响，这 里线粒体功能紊乱主 要表现为线粒体呼吸 作用增强 化合物处理24 h后，线 粒体数量增加
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细胞毒性检测：成像
Control 30 µM FCCP 300 µM Tacrine 100 mM AAP
细胞计数 细胞膜透性 线粒体数量 细胞核增大/皱缩
Hoechst 33342 BOBO-3 (not displayed), Hoechst 33342 MitoTracker® Deep Red Hoechst 33342
50 ng/ml TNF
HEK293细胞稳定表达NF-B家族 带 HaloTag® 融合标签的p65 (p65-HT) ，通过 HaloTag® TMR 配体透过细胞膜染活细胞 用不同浓度TNF 刺激NF-B 信号 用Operetta® 高内涵系统成像，40x LWD 物镜荧光宽场
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TNF induces nuclear import of p65
1750 1500 1250 1000 750 500 -3 -2 -1 FCCP 0.5 礛 0 1 Tacrine 72.4 礛 2 3 4 5 6 Log compound [礛 ] EC50 AAP 1.3 mM
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细胞毒性检测结果II- 细胞核面积和荧光强度
250
14000 12000