噬菌体展示系统

其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌 毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白 结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚 定于噬菌体的一端。PⅢ有2个位点可供外源序列 插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的 信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的 PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或 蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体 丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬 菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易 被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时， 可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白， 即所谓“单价”噬菌体。
• 1990年McCafferty等又在此基础上构建了 库容为106的抗体库,并从中成功地筛选出 了溶菌酶单链抗体后,噬菌体抗体库技术成 为了抗体工程中的一种新兴的抗体制备的 手段。 • 近年来，随着分子生物学的不断发展,利用 基因工程手段获得基因工程抗体的方法成 为抗体技术研究的热点.
2.噬菌体展示技术的简介： 是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入 到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置， 使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同 时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到 噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人 们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ 噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数 种噬菌体展示系统。
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3.增殖：包括核酸的复制和蛋白质的生 物合成。首先，噬菌体一起核算中的遗 传信息向宿主细胞发出指令并提供“蓝 图”，使宿主细胞的代谢系统按严密程 序、有条不紊地逐一转向或适度改造， 从而转变成能有效合成噬菌体所特有的 组分和“部件”，其中所需“原料”可 通过宿主细胞原有核酸等的降解、代谢 库内的贮存物或从外界环境中取得。一 旦大批成套的“部件”已合成，就在细 胞“工厂”里进行突击装配，于是就产 生了一大群形状、大小完全相同的子代 噬菌体。
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5.裂解：当宿主细胞内的大量子代噬菌 体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和 水解细胞壁的溶菌酶等的作用，促进了 细胞的裂解，从而完成子代噬菌体的释 放。
噬菌体侵染过程如下：
噬菌体的侵染过程示意图：
噬菌体的侵染实验的研究证明了 DNA是遗传物质
二、噬菌体展示及抗体库技术
（一）噬菌体展示技术： • 1.展示技术的发展历程 1985年,Smith第一次成功 地将EcoRⅠ核酸内切酶基 因插入丝状噬菌体基因pⅢ 中,并在噬菌体表面表达出了 融合的蛋白。
第二章 噬菌体的相关技术
一、噬菌体的侵染过程：
• • • • • 1.吸附 2.侵入 3.增殖 4.成熟（装配） 5. 释放
• 1.吸附：当噬菌体与其相应的特异宿主在水 环境中发生偶然碰撞后，如果尾丝尖端与 宿主细胞表面的特异性受体（蛋白质、多 糖或者脂蛋白-多糖复合物等）接触后，就 可触发颈须把卷紧的尾丝散开，随即就附 着在受体上，从而把刺突、基板固着于细 胞表面。 吸附作用受许多外来因素的影响，如 噬菌体的数量，阳离子浓度，温度和辅助 因子（色氨酸、生物素等）
• 4.噬菌体展示系统： 单链丝状噬菌体展示系统 ： （1）PⅢ展示系统:丝状噬菌体是单链DNA 病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病 毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌 所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷 贝PⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和 CT 3个功能区域，这3个功能区域由两段富 含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。
（2）PⅧ及其他展示系统：PⅧ是丝状噬菌 体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，C端 与DNA结合，N端伸出噬菌体外，每个病毒 颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝。PⅧ的N端附 近可融合五肽，但不能融合更长的肽链， 因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍， 影响噬菌体装配，使其失去感染力。但有 辅助噬菌体参与时，可提供野生型PⅧ蛋白， 降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。
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4.成熟（装配）：噬菌体的成熟过程事 实上就是把已合成的各种“部件”进行 自装配的过程。在T4噬菌体的装配过程 中，约需30种不同蛋白质和至少47个基 因参与，其装配过程主要步骤有：DNA 分子的缩合，通过衣壳包裹DNA而形成 完整的头部，尾丝和尾部的其他“部件” 独立装配完成，头部和尾部相结合后， 最后再装上尾丝。
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2.侵入：吸附后尾丝收缩，基板从尾丝 中获得一个构象刺激，促使尾鞘中的144 个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩 成原长的一半，由此把尾管推出并插入 细胞壁和膜中。此时尾管端所携带的少 量溶菌酶可把细胞壁上的肽聚糖水解， 以利侵入。头部的核酸迅速即通过尾管 及其末端小孔注入宿主细胞中，并将蛋 白质躯壳留在壁外。从吸附到侵入的时 间极短，例如T4只需15s。
3.噬菌体展示技术的原理： 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的 编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正 确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况 下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表 达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而 展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白 可以保持相对独立的空间结构和生物活性， 以利于靶分子的识别和结合。
此外，尚有丝状噬菌体PⅥ展示系统的 研究报道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表 面，可以作为外源蛋白的融合位点，可以 用于研究外源蛋白C端结构区域功能。从所 掌握的文献来看，该系统主要用于cDNA表 面展示的构建，并取得了不错的筛选 效果。
λ噬菌体展示系统： （1）PV展示系统：λ噬菌体的PV蛋白构成了它的 尾部管状部分，该管状结构由32个盘状结构组成， 每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域， C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插 入或替换。目前，用PV系统已成功展示了有活性 的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465 ku）和植物外 源凝血素BPA（120 ku）等。λ噬菌体的装配在 细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。 该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子 /噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能 时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体， 然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合 吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细 胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3 轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分 子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得 的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望 结合特性的目标噬菌体。