免疫组化技术 ppt课件
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采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测 定细胞和组织中的抗原。
Envision：
原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP） 复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多 的HRP分子，使信号有显著提高，敏感性较PAP法，ABC 法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在， 无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗 体孵育时间短，该方法更省时，简便。
➢酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作 用 ， 可 形 成 不 同 颜 色 的 终 产 物 。 用 新 品 红 （ New fuchsine）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉 淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,)
分布，定位，定量；
蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等
材料：
•抗体：
✓多 克 隆抗 体 ：为 针 对多 个 抗原 决 定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。
✓单 克 隆 抗 体 ： 为 一 个 B 淋 巴 细 胞 分 化 增 殖 产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
显示物：
HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕 色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
➢荧光标记：荧光素标记抗体
•异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ Fluorescien isothioyarale, FITC）520－530nm
•四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm
以LSAB法为例简单介绍染色步骤： ①石蜡切片脱蜡－水； ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min； ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育 5min； ④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过夜； ⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C ，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素 ，370C， 30min；
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min；
⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－15min。 在光镜下观察。
⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理： ✓组织材料的处理：
固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性 ③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
淋巴细胞标记物： 白细胞共同抗原（LCA, CD45）：主要分布于T, B细胞，
单核细胞，粒细胞表面。 CD20： B细胞标记物。 CD45RO、CD3：T细胞标记物。 CD57：为自然杀伤细胞的标记物。 CD38：为浆细胞的标记物。 CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。
神经内分泌标记物： 嗜铬素A（Chromogranin, CgA）：
存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。 突触素（Synaptophysin, Sy）：
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞 的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜 表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并 以此作为定性、定量和定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间 有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而 是累及一片细胞，两者可显著区别。
阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种：
✓合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体； 浓缩型。
✓减少或消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
✓对照：
阳性对照：用一直抗原阳性的切片与 待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对 照应呈阳性结果，即为阳性对照。
阴性对照：用不含一直抗原的标本作 对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性 对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑 制对照等，用以排除假阳性结果。
固定时间：8-24hr 组织大小：2*1.5*0.3cm
✓Βιβλιοθήκη Baidu脱片处理： 多聚-L-赖氨酸； 硫酸铬钾明胶液。
✓增强特异性染色的措施和方法： 1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化
（0.05-0.1%）； b、胃蛋白酶消化（0.4%）。 2）热诱导的抗原修复： 方法：微波960C, 10min； 直接加温方法 1000C, 10min； 高压锅 1200C, 10min； 热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
组织化学技术
组织化学的基本概念：
组织化学：组织水平，对组织内存在的各种物 质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分 析的方法
• 免疫组织化学：基于抗原抗体反应
• 酶组织化学
疾病的病理学研究概括起来主要在基因和蛋白 水平上进行的研究。
免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平 表达的研究。
蛋白表达=>
•ABC法：
生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高 度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生 物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体 结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上 生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物 素的结合反应，而以适当方式显示。
S-P法（LSAB）：
存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞， 神经内分泌细胞中。 髓磷脂硷性蛋白（Myelin basic protein, MBP）：
•四 乙 基 罗 达 明 （ Teraethyle rhodamine B200, RB200）590－600nm
➢胶体金： •指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中， •免疫电镜观察
主要方法： •直接法： •间接法：经过了第二抗体放大效应
PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合
物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以 酶底物反应检出。
Envision：
原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP） 复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多 的HRP分子，使信号有显著提高，敏感性较PAP法，ABC 法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在， 无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗 体孵育时间短，该方法更省时，简便。
➢酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作 用 ， 可 形 成 不 同 颜 色 的 终 产 物 。 用 新 品 红 （ New fuchsine）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉 淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,)
分布，定位，定量；
蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等
材料：
•抗体：
✓多 克 隆抗 体 ：为 针 对多 个 抗原 决 定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。
✓单 克 隆 抗 体 ： 为 一 个 B 淋 巴 细 胞 分 化 增 殖 产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
显示物：
HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕 色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
➢荧光标记：荧光素标记抗体
•异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ Fluorescien isothioyarale, FITC）520－530nm
•四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm
以LSAB法为例简单介绍染色步骤： ①石蜡切片脱蜡－水； ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min； ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育 5min； ④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过夜； ⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C ，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素 ，370C， 30min；
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min；
⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－15min。 在光镜下观察。
⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理： ✓组织材料的处理：
固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性 ③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
淋巴细胞标记物： 白细胞共同抗原（LCA, CD45）：主要分布于T, B细胞，
单核细胞，粒细胞表面。 CD20： B细胞标记物。 CD45RO、CD3：T细胞标记物。 CD57：为自然杀伤细胞的标记物。 CD38：为浆细胞的标记物。 CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。
神经内分泌标记物： 嗜铬素A（Chromogranin, CgA）：
存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。 突触素（Synaptophysin, Sy）：
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞 的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜 表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并 以此作为定性、定量和定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间 有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而 是累及一片细胞，两者可显著区别。
阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种：
✓合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体； 浓缩型。
✓减少或消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
✓对照：
阳性对照：用一直抗原阳性的切片与 待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对 照应呈阳性结果，即为阳性对照。
阴性对照：用不含一直抗原的标本作 对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性 对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑 制对照等，用以排除假阳性结果。
固定时间：8-24hr 组织大小：2*1.5*0.3cm
✓Βιβλιοθήκη Baidu脱片处理： 多聚-L-赖氨酸； 硫酸铬钾明胶液。
✓增强特异性染色的措施和方法： 1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化
（0.05-0.1%）； b、胃蛋白酶消化（0.4%）。 2）热诱导的抗原修复： 方法：微波960C, 10min； 直接加温方法 1000C, 10min； 高压锅 1200C, 10min； 热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
组织化学技术
组织化学的基本概念：
组织化学：组织水平，对组织内存在的各种物 质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分 析的方法
• 免疫组织化学：基于抗原抗体反应
• 酶组织化学
疾病的病理学研究概括起来主要在基因和蛋白 水平上进行的研究。
免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平 表达的研究。
蛋白表达=>
•ABC法：
生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高 度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生 物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体 结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上 生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物 素的结合反应，而以适当方式显示。
S-P法（LSAB）：
存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞， 神经内分泌细胞中。 髓磷脂硷性蛋白（Myelin basic protein, MBP）：
•四 乙 基 罗 达 明 （ Teraethyle rhodamine B200, RB200）590－600nm
➢胶体金： •指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中， •免疫电镜观察
主要方法： •直接法： •间接法：经过了第二抗体放大效应
PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合
物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以 酶底物反应检出。