抗病毒

1 病毒感染细胞，毒力测定

①将-70℃保存病毒以半对数法稀释10个稀释度，分别感染在96孔板中长成的细胞；

②每个稀释度接种4个复孔，置34℃培养，逐日观察，连续观察3天；

③根据CPE或MTT法结果，计算100TCID50

④临用前，根据计算结果将-70℃保存病毒稀释至100TCID50/50μl。

2首先药物对细胞的毒性实验

①药物配制，浓度自己定，临用前用无菌的孔径φ0.22μm微孔滤膜过滤除细菌；

②用细胞维持液将药物稀释成1∶2、1∶5、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶104、1∶105，分别加入96孔板中已长成单层的细胞中，每个稀释度接种4个复孔，每孔加入100μl，置于37℃二氧化碳培养箱中培养，逐日观察药液对细胞有无毒性作用，并与不加样品的正常细胞组（CK0）对照；

③连续观察5天，观察并记录细胞病变（CPE）结果，选对细胞无毒性的药物最大稀释度（TC0）供下一步实验。

3药物体外抗病毒活性实验

1 同时法测定药物抗病毒活性

根据细胞毒性实验结果，将待测药物进行半对数稀释成5个浓度，使得最高浓度为最大无毒浓度（TC0）。

①实验组：在96孔板已长成的细胞中加入不同浓度的药液，每孔加入50μl，每浓度做4个复孔，同时加入100TCID50的HSV病毒即50μl稀释后的病毒液，放入33℃二氧化碳培养箱中培养3小时，吸出孔中液体，用病毒稀释液洗涤3遍，每孔加入100μl细胞维持液，33℃培养，逐日观察并记录CPE结果，连续观察3天。②阳性对照组：按照“实验组”方法操作。③病毒对照组：感染100TCID50的HSV病毒，把药液换成病毒稀释液，每板设置8孔。另外同时设药物对照和细胞对照。

2 治疗法测定药物抗病毒活性

①实验组：在96孔板已长成的细胞中加入100TCID50的HSV病毒即50μl稀释后的病毒液，33℃二氧化碳培养箱中吸附1小时，弃去病毒液，并用病毒稀释液洗涤3遍，在96孔板已长成单层的细胞中加入不同浓度的药液，每孔加入100μl，每浓度做4个复孔，33℃培养，逐日观察并记录CPE结果，连续观察3天。

②阳性对照组：按照“实验组”方法操作。③病毒对照组：感染100TCID50的HSV病毒，把药液换成病毒稀释液，每板设置8孔。另外同时设药物对照和细胞对照。

3 预防法测定药物抗病毒活性

①实验组：在96孔板已长成细胞中加入不同浓度的药液，每孔加入100μl，每浓度做4个复孔，33℃培养24小时，病毒稀释液洗涤3次，同时加入100TCID50的HSV病毒即50μl稀释后的病毒液，放入33℃二氧化碳培养箱中吸附1小时，吸出孔中液体，用病毒稀释液洗涤3遍，每孔加入100μl细胞维持液，33℃培养，逐日观察并记录CPE结果，连续观察3天。②阳性对照组：按照“实验组”方法操作。③病毒对照组：感染100TCID50的HSV病毒，把药液换成病毒稀释液，每板设置8孔。另外同时设药物对照和细胞对照。

4 管外法测定药物抗病毒活性

①实验组：在EP管中分别加入不同浓度的药液，每管加入50μl，每浓度做4个复孔，同时加入100TCID50的HSV病毒即50μl稀释后的病毒液，放入33℃二氧化碳培养箱中培养2小时，吸出96孔板中液体，用病毒稀释液洗涤3遍，每孔加入100μl药物病毒混和液，33℃培养1小时后，吸出孔中液体，用病毒稀释液洗涤3遍，逐日观察并记录CPE结果，连续观察3天。②阳性对照组：阳性对照药，按照“实验组”方法操作。③病毒对照组：感染100TCID50的HSV病毒，把药液换成病毒稀释液，每板设置8孔。另外同时设药物对照和细胞对照。

测定建议使用MTT法！

100TCID50的计算