Part3-2-神经生物物理-离子通道
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离子通道cDNA 与基因 基因的分离与克隆
离子通道在组织间的分布 原位杂交，RT-PCR，免疫组化
离子通道与疾病 及治疗
离子通道药物 结构与功能的关系
离子通道基因突变的检测基因治疗 特异的阻断剂和开放剂等，作用位点 离子通道的异源表达，电生理
通道三维结构
通道蛋白的制备，晶体衍射等
32
离子通道的异源表达方法
H+ channel
称呼：电压依赖性K+ 通道 KV ATP敏感的K+ 通道 KATP 内向整流型K+通道 KIR (Inward rectifier potassium channel)
45
§2.3 电压门控的离子通道
一 门控过程：
46
二 闸门电流 (gating current)
是指在外部电场作用下，电压依赖性通道口或其附 近的带电闸门颗粒移动所产生的非对称电流，这些 闸门颗粒决定通道的开闭。目前，与电压依赖性钠 通道、钾通道、 钙通道开放有联系的闸门电流可 测量，并发现某些药物能改变闸门电流，说明其对 闸门机制有影响。
26
几种patching方法： attached outside-out inside-out
whole cell
Difference between Patch-clamp and voltage-clamp
27
下面请观看一段自动化膜片钳技术实施方法的视频
28
二、离子通道药理学 通道特异性的开放剂和阻断剂
channel 的 Inactivation 状态。
52
四 电压门控的离子通道基本的分子结构：
4 subunits (K+ channel) or 4 domain (Na+ channel and Ca 2+ channel) make up each channel Each subunit (domain) contain 6 transmembrane α- helix segments S1-S6
53
54
K+ channel:
made up by 4 identical or different molecular protein
Outside S1 S2 S3 S4 S5 S6 Inside
HO2C
H2 N
55
K+ channel:
56
Ca2+ and Na+ channel:
made up by a big single molecular protein, containing 4 domains, each domain has 6 transmembrane segments
Expression vector:
Molecular biology techniques
Host cell:
cultured mammalian cell Toda oocytes卵母细胞
Function checking: voltage clamp or patch clamp Ca2+ imaging X-ray or EM
GABA and Glycine receptor (Cl- channel) P2X, extracellular ATP, nonselective cation channel
细胞内配体：KATP, ATP sensitive K+ channel
KCa, Ca2+ activated K+ channel
4. Gating (the change between opening
and closing state of ion channels)
41
42
离子通道的类型
按 gating signal 分类： 电压门离子通道： K+ channel, Ca2+ channel, Na+ channel, 配体门离子通道： 细胞外配体：AchR (non-selective cation channel)
16
Patch-clamp（膜片钳）实验装置
膜片钳放大器
模数转换
探头
单细胞
样品池 计算机
17
膜片钳实验装 置示意图:
大鼠肌肉单通道离 子电流记录曲线:
向上为通道开放
19
20
21
低电阻封接 50MΩ
How to do patch clamp
细胞贴附式 高电阻封接 109Ω
脉冲抽吸
Whole cell
Chapter 2 生物膜离子通道
1
离子通道： 是一类跨膜糖蛋白，它们在细胞膜上形成的亲水性孔道 使带电荷的离子得以进行跨膜转运，是神经、肌肉、腺 体等许多组织细胞膜上的基本兴奋单元，它们能产生和 传导电信号，具有重要的生理功能。 离子通道转运的特点： 驱动力为电化学梯度
无饱和现象
极高的转运速率 并非连续开放而是门控的
从离子平衡电位的角度解释电压钳的结果：
K+ outward current
Na+ inward current
15
膜片钳（patch clamp） ----单离子通道电流记录技术
1976 Neher and Sakmann (Nature) 1991 Nobel Prize 从voltage-clamp发展而来。用一根经过抛光的微吸管 吸到几个μm2的膜面积，该面积上只有一个或几个离 子通道，微吸管内加一个负压，可将微吸管与膜封接 非常紧密，内外电阻高达109Ω，从而将微吸管内的细 胞膜与其它部分隔离，在该部分记录的电流为单通道 电流。
Ion channel-vector put into host cell
Ion Channel properties recording (elctrophysiology, Ca2+ imaging)
37
How to put ion channel cDNA into vector？
目的： 离子通道蛋白可以被表达 获得研究的“原材料” 对离子通道蛋白进行改造，可操作 Vector + Ion channel cDNA
8
电压钳实验 的装置图：
9
电压钳的实验：
电压钳实验所记录到的电流： 内向电流 外向电流 电容放电电流
10
方法一
（1）膜电压从－65mV（静息电位）去极化到 －10mV
溶液中去除了Na+
（2）膜电压从－65mV（静息电位）去极化到 －10mV 溶液中去除了K+
11
结果：
－10mV －65mV 0 IK I
36
实验流程：
Clone ion channel cDNA ion channel cDNA (wild type)
mutagenesis
Recombinant DNA
Mutated ion channel cDNA
Put into expression vector
Transfection Micro injection
2
离子通道的生理功能：
可兴奋细胞 膜电位变化 电信号
非兴奋细胞
Ca2+变化
细胞信号转导
基因表达等
3
§2.1 离子通道的研究方法
电生理技术：细胞膜电位记录，电压钳，膜片钳 离子通道药理学方法：激动剂， 阻断剂
分子生物学方法：
其他：Ca2+-imaging，晶体衍射，电镜技术
4
一 电生理技术：
细胞膜电位、电流记录
电压钳 膜片钳
5
电压钳（voltage-clamp）
Na+内流为正反馈系统，难于分析。
6
Hodgkin和Huxley用电压钳技术发现了神经动作电位的离 子机制，从而获得1963年Nobel医学和生理学奖。
7
电压钳技术的原理：
用一个补偿电流通过膜，从而维持膜电压的恒定，可 用来分析膜电流是由何种离子携带的。通过插入细胞 内的一根微电极向胞内补充电流，补充的电流量正好 等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发生 改变，也能控制膜电位数值不变。经过离子通道的离 子流与经微电极施加的电流方向相反，数量相等。因 此可以定量测定细胞兴奋时的离子电流。膜通透性的 改变是迅速的，但如使用一个高频响应的放大器，可 以连续、快速、自动地调整注入电流，达到保持膜电 位恒定的目的。
47
三 电压门控的离子通道的几种工作状态
Resting available (closed) Activated (open) Deactivated (return to resting available， closed) Inactivation (closed during maintained depolarization) （closed）
put ion channel cDNA into vector
基因克隆和DNA重组
38
分子生物学在离子通道研究中的应用：
1 单种通道的功能和特异性 2 离子通道结构与功能的关系 3 通道的空间结构和作用过程
4 克隆和寻找新的离子通道
5 离子通道与疾病的发生的关系 6 以离子通道为靶点开发临床药物
activation deactivation
C
O
inactivation
I
48
49
－10mV
－65mV IK no inactivation
0
deactivation INa Inactivation
Ion channel working states
50
0 mV
Voltage pulse
-70 mV
39
其他方法：
Ca2+-imaging： 钙离子相关通道
X-晶体衍射，电镜技术： 通道的空间结构
40
§2.2 离子通道的特性和分类
1. Formed by aggregation of subunits (domains) 2. Ions cross through channel driving by electrical potential and their concentration difference across cell membrane 3. Selectivity (K+ channel, Na+ channel, cation channel, ect.)
Outside-out
Inside-out
22
23
将电极吸附的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外侧向 外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。对小细胞的电 压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。
24
25
膜片钳记录有单通道膜片钳和全细胞膜
片钳两种模式。
单通道模式包括细胞贴附模式、内膜外 向模式、外膜外向模式三种。 全细胞模式有传统全细胞膜片钳和穿孔 膜片钳之分。
INa
电容放电的电流
12
方法二 分别阻断钠通道和钾通道：
胞外
gK
gCl ECl
胞内
gNa
Cm
EK
ENa
13
河豚毒素（阻断钠通道）
四乙基胺（阻断钾通道）
Voltage-clamp recording from neuro
14
结论：
在膜电位为–10 mV时，钠离子内流，形成内向电流， 钾离子外流，形成外向电流。
机械门离子 channel: Na+ channles Ca2+ channels: L-type, T-type, IP3R KV, KIR, Kca, KATP
Cl- channel: voltage gated; ligand gated GABA and glycine receptors
29
三、分子生物学方法进行离子通道研究
Na channel gene protein sequence 1983
K channel shaker gene clone 1992
30
常用的分子生物学的方法：
基因的分离与克隆 原位杂交 离子通道的异源表达 通道蛋白的制备 离子通道基因突变的检测
31
分子生物学的应用：
33
34
异源表达的优点：
单一通道，简单 通道可以被改造， cDNA mutation
异源表达方法的应用：
研究结构与功能的关系
确认新克隆的离子通道 筛选单一通道的激动剂或阻断剂
35
进行异源表达需要：
Ion channel cDNA:
wild type ion channel mutated ion channel plasmid (with transfection marker)
0 uA
activation
inactivation
Ca current Inward current
0 uA
activation
deactivation
Ca currrent Inward current
Ion channel working states
不同的通道关闭机制不同，是通过Inactivation or Deactivation，取决于通道本身。 在神经细胞动作电位中，绝对不应期对应 Na+
离子通道在组织间的分布 原位杂交，RT-PCR，免疫组化
离子通道与疾病 及治疗
离子通道药物 结构与功能的关系
离子通道基因突变的检测基因治疗 特异的阻断剂和开放剂等，作用位点 离子通道的异源表达，电生理
通道三维结构
通道蛋白的制备，晶体衍射等
32
离子通道的异源表达方法
H+ channel
称呼：电压依赖性K+ 通道 KV ATP敏感的K+ 通道 KATP 内向整流型K+通道 KIR (Inward rectifier potassium channel)
45
§2.3 电压门控的离子通道
一 门控过程：
46
二 闸门电流 (gating current)
是指在外部电场作用下，电压依赖性通道口或其附 近的带电闸门颗粒移动所产生的非对称电流，这些 闸门颗粒决定通道的开闭。目前，与电压依赖性钠 通道、钾通道、 钙通道开放有联系的闸门电流可 测量，并发现某些药物能改变闸门电流，说明其对 闸门机制有影响。
26
几种patching方法： attached outside-out inside-out
whole cell
Difference between Patch-clamp and voltage-clamp
27
下面请观看一段自动化膜片钳技术实施方法的视频
28
二、离子通道药理学 通道特异性的开放剂和阻断剂
channel 的 Inactivation 状态。
52
四 电压门控的离子通道基本的分子结构：
4 subunits (K+ channel) or 4 domain (Na+ channel and Ca 2+ channel) make up each channel Each subunit (domain) contain 6 transmembrane α- helix segments S1-S6
53
54
K+ channel:
made up by 4 identical or different molecular protein
Outside S1 S2 S3 S4 S5 S6 Inside
HO2C
H2 N
55
K+ channel:
56
Ca2+ and Na+ channel:
made up by a big single molecular protein, containing 4 domains, each domain has 6 transmembrane segments
Expression vector:
Molecular biology techniques
Host cell:
cultured mammalian cell Toda oocytes卵母细胞
Function checking: voltage clamp or patch clamp Ca2+ imaging X-ray or EM
GABA and Glycine receptor (Cl- channel) P2X, extracellular ATP, nonselective cation channel
细胞内配体：KATP, ATP sensitive K+ channel
KCa, Ca2+ activated K+ channel
4. Gating (the change between opening
and closing state of ion channels)
41
42
离子通道的类型
按 gating signal 分类： 电压门离子通道： K+ channel, Ca2+ channel, Na+ channel, 配体门离子通道： 细胞外配体：AchR (non-selective cation channel)
16
Patch-clamp（膜片钳）实验装置
膜片钳放大器
模数转换
探头
单细胞
样品池 计算机
17
膜片钳实验装 置示意图:
大鼠肌肉单通道离 子电流记录曲线:
向上为通道开放
19
20
21
低电阻封接 50MΩ
How to do patch clamp
细胞贴附式 高电阻封接 109Ω
脉冲抽吸
Whole cell
Chapter 2 生物膜离子通道
1
离子通道： 是一类跨膜糖蛋白，它们在细胞膜上形成的亲水性孔道 使带电荷的离子得以进行跨膜转运，是神经、肌肉、腺 体等许多组织细胞膜上的基本兴奋单元，它们能产生和 传导电信号，具有重要的生理功能。 离子通道转运的特点： 驱动力为电化学梯度
无饱和现象
极高的转运速率 并非连续开放而是门控的
从离子平衡电位的角度解释电压钳的结果：
K+ outward current
Na+ inward current
15
膜片钳（patch clamp） ----单离子通道电流记录技术
1976 Neher and Sakmann (Nature) 1991 Nobel Prize 从voltage-clamp发展而来。用一根经过抛光的微吸管 吸到几个μm2的膜面积，该面积上只有一个或几个离 子通道，微吸管内加一个负压，可将微吸管与膜封接 非常紧密，内外电阻高达109Ω，从而将微吸管内的细 胞膜与其它部分隔离，在该部分记录的电流为单通道 电流。
Ion channel-vector put into host cell
Ion Channel properties recording (elctrophysiology, Ca2+ imaging)
37
How to put ion channel cDNA into vector？
目的： 离子通道蛋白可以被表达 获得研究的“原材料” 对离子通道蛋白进行改造，可操作 Vector + Ion channel cDNA
8
电压钳实验 的装置图：
9
电压钳的实验：
电压钳实验所记录到的电流： 内向电流 外向电流 电容放电电流
10
方法一
（1）膜电压从－65mV（静息电位）去极化到 －10mV
溶液中去除了Na+
（2）膜电压从－65mV（静息电位）去极化到 －10mV 溶液中去除了K+
11
结果：
－10mV －65mV 0 IK I
36
实验流程：
Clone ion channel cDNA ion channel cDNA (wild type)
mutagenesis
Recombinant DNA
Mutated ion channel cDNA
Put into expression vector
Transfection Micro injection
2
离子通道的生理功能：
可兴奋细胞 膜电位变化 电信号
非兴奋细胞
Ca2+变化
细胞信号转导
基因表达等
3
§2.1 离子通道的研究方法
电生理技术：细胞膜电位记录，电压钳，膜片钳 离子通道药理学方法：激动剂， 阻断剂
分子生物学方法：
其他：Ca2+-imaging，晶体衍射，电镜技术
4
一 电生理技术：
细胞膜电位、电流记录
电压钳 膜片钳
5
电压钳（voltage-clamp）
Na+内流为正反馈系统，难于分析。
6
Hodgkin和Huxley用电压钳技术发现了神经动作电位的离 子机制，从而获得1963年Nobel医学和生理学奖。
7
电压钳技术的原理：
用一个补偿电流通过膜，从而维持膜电压的恒定，可 用来分析膜电流是由何种离子携带的。通过插入细胞 内的一根微电极向胞内补充电流，补充的电流量正好 等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发生 改变，也能控制膜电位数值不变。经过离子通道的离 子流与经微电极施加的电流方向相反，数量相等。因 此可以定量测定细胞兴奋时的离子电流。膜通透性的 改变是迅速的，但如使用一个高频响应的放大器，可 以连续、快速、自动地调整注入电流，达到保持膜电 位恒定的目的。
47
三 电压门控的离子通道的几种工作状态
Resting available (closed) Activated (open) Deactivated (return to resting available， closed) Inactivation (closed during maintained depolarization) （closed）
put ion channel cDNA into vector
基因克隆和DNA重组
38
分子生物学在离子通道研究中的应用：
1 单种通道的功能和特异性 2 离子通道结构与功能的关系 3 通道的空间结构和作用过程
4 克隆和寻找新的离子通道
5 离子通道与疾病的发生的关系 6 以离子通道为靶点开发临床药物
activation deactivation
C
O
inactivation
I
48
49
－10mV
－65mV IK no inactivation
0
deactivation INa Inactivation
Ion channel working states
50
0 mV
Voltage pulse
-70 mV
39
其他方法：
Ca2+-imaging： 钙离子相关通道
X-晶体衍射，电镜技术： 通道的空间结构
40
§2.2 离子通道的特性和分类
1. Formed by aggregation of subunits (domains) 2. Ions cross through channel driving by electrical potential and their concentration difference across cell membrane 3. Selectivity (K+ channel, Na+ channel, cation channel, ect.)
Outside-out
Inside-out
22
23
将电极吸附的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外侧向 外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。对小细胞的电 压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。
24
25
膜片钳记录有单通道膜片钳和全细胞膜
片钳两种模式。
单通道模式包括细胞贴附模式、内膜外 向模式、外膜外向模式三种。 全细胞模式有传统全细胞膜片钳和穿孔 膜片钳之分。
INa
电容放电的电流
12
方法二 分别阻断钠通道和钾通道：
胞外
gK
gCl ECl
胞内
gNa
Cm
EK
ENa
13
河豚毒素（阻断钠通道）
四乙基胺（阻断钾通道）
Voltage-clamp recording from neuro
14
结论：
在膜电位为–10 mV时，钠离子内流，形成内向电流， 钾离子外流，形成外向电流。
机械门离子 channel: Na+ channles Ca2+ channels: L-type, T-type, IP3R KV, KIR, Kca, KATP
Cl- channel: voltage gated; ligand gated GABA and glycine receptors
29
三、分子生物学方法进行离子通道研究
Na channel gene protein sequence 1983
K channel shaker gene clone 1992
30
常用的分子生物学的方法：
基因的分离与克隆 原位杂交 离子通道的异源表达 通道蛋白的制备 离子通道基因突变的检测
31
分子生物学的应用：
33
34
异源表达的优点：
单一通道，简单 通道可以被改造， cDNA mutation
异源表达方法的应用：
研究结构与功能的关系
确认新克隆的离子通道 筛选单一通道的激动剂或阻断剂
35
进行异源表达需要：
Ion channel cDNA:
wild type ion channel mutated ion channel plasmid (with transfection marker)
0 uA
activation
inactivation
Ca current Inward current
0 uA
activation
deactivation
Ca currrent Inward current
Ion channel working states
不同的通道关闭机制不同，是通过Inactivation or Deactivation，取决于通道本身。 在神经细胞动作电位中，绝对不应期对应 Na+