铁皮石斛组培技术

铁皮石斛组培技术-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
铁皮石斛的组织培养研究
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课程：植物组织培养
目录
摘要 (4)
Abstract (5)
前言 (6)
1.培养基 (7)
1.1配方 (7)
1.2配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例） (7)
1.3灭菌 (9)
2.转接 (10)
2.1转接前准备 (10)
2.2转接 (10)
2.3培养 (10)
3.炼苗 (11)
3.1炼苗目的 (11)
3.2炼苗方法 (11)
4.移栽 (12)
4.1基质选择 (12)
4.2移栽技术要求 (12)
5.结论与分析 (13)
参考文献 (14)
摘要
铁皮石斛(Dendrobium officinale)是兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw．)多年生草本植物。

铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。

铁皮石斛是传统名贵中药材，有生津益胃、清热养阴和清咽利嗓等功效，主要药用成分石斛多糖是一种免疫调节剂。

铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低。

为了保护和有效利用铁皮石斛，通过组织培养技术大量快速繁殖铁皮石斛组培苗显得尤为重要。

关键词：铁皮石斛组织培养移栽培养基转接快速繁殖
Abstract
Dendrobium orchid Dendrobium is a perennial herb. It is the ultimate in DendrobiumSw,named for its ferric green epidermis.As a rare traditional Chinese herbal medicine,it contributes to dry dampness and strengthen the spleen,clear away lung-heat ,nourish yin ，clear away heat ,and so on.The main medicinal components of Dendrobium polysaccharide is a kind of immune modulators.When mature,its capsule cracks,in which seeds are in small particle size and have a low rate of natural reproduction.In order to protect and utilize the Dendrobium orchid Dendrobium ,it is particularly important to establish a rapid propagation by the tissue culture technique .
key words:Dendrobium orchid Dendrobium tissue culture
culture medium adapter rapid propagation
前言
多年生草本，具有气生根。

茎直立丛生、高30-50cm，肉质稍扁，有节、有
槽沟，黄绿色。

单叶互生，叶片革质，无柄，狭长椭圆形或近披针形，叶鞘抱茎。

总状花序腋生，每个花序有花2-3朵，白色，先端淡紫红色。

铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物。

作为我国传统的名贵中药,具有重要的药用价值。

由于长期过度采挖,加之本身繁殖率低,导致其野生资源急剧减少,日趋濒危,现已被列为国家重点保护植物,成为国家重点保护的药材品种。

试验结果表明,MS、N6和B5等3种基本培养基对铁皮石斛芽诱导和增殖的效果, B5要优于其他基本培养基;在激素浓度配中,铁皮石斛原球茎在6-
BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L中,增殖系数最大;天然附加物对铁皮石斛增殖的影响差异很大,实际应用中宜选用香蕉汁为添加剂;在B5+蔗糖30g/L+香蕉汁100mg/L+
琼脂5.8g/L基本培养基中,加入的NAA对铁皮石斛芽的生根以1.0mg/L处理的效果最好,但考虑到NAA价格较贵,且在浓度范围为0.2-1.0之间对生根的影响差异不明显,在实际应用中以选用0.2mg/L的NAA为好;生成的小苗经过炼苗后,在铺有一层苔藓的含有75％锯末+20％泥炭土+5％碎磁片的基质上能够良好的生长。

1.培养基
1.1配方
根据不同阶段，培养基配方有所差异。

如表1-1
表1-1 各种培养基配方
不同阶段培养基备注
愈伤组织（原球茎）的诱导MS+2.0mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%琼
脂
pH=5.8
原球茎的增殖MS+20%马铃薯+3%蔗糖+0.8%琼脂pH =5.8
原球茎的分化MS+20%马铃薯+2.0mg/LNAA+3%
蔗糖+0.8%琼脂
pH=5.8
幼株的生根壮苗MS+10%香蕉+2.0mg/LNAA+3%蔗
糖+0.8%琼脂
pH=5.4-5.6
1.2配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例）
配方：10%香蕉（w/w）+MS +3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/L NAA 1）量取800ml蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾；
2）准确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解；
3）按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序，量取MS各种母液于盛有50ml蒸馏水的烧杯，混合均匀；
4）将2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2ml NAA
（0.1mg/ml），混合均匀；
5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解；
6）冷却至50±5℃时，调pH至5.4—5.6。

分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。

培养基附加物：
（1）天然添加物
在基本培养基中加人香蕉汁、马铃薯汁、绿豆芽汁、苹果汁仁、椰子乳等能促进铁皮石斛幼苗的生长和根系的发育，香蕉汁的促进作用最为显著。

（2）炭源
铁皮石斛在生根培养时加入活性炭有利于试管苗的生长，能使根系长得更加粗壮闭。

唐桂香等认为在培养基中添加活性炭有助于提高试管苗的成活率，但对苗的根数和根长影响小。

注意事项
①溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解；
②各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ的顺序；
③煮沸时，小心溶液溢出；
④分装时不要污染培养瓶瓶口。

1.3灭菌
1.3.1培养基灭菌
1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；
2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；
3）打开电源和排气阀，调节电压至220V；
4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀；
5）当温度上升到121℃后，调节电压至135V，保持20min；
6）关闭电源，使之自动降温至0℃。

10min后，打开排气阀和锅盖；
7）5—10min后，取出培养基放于试验台上冷却，待用。

表1-2 灭菌时间统计
阶段单锅灭菌（耗时
64min）
多锅连续灭菌
第一锅（耗时
63min）
第二锅（耗时
46min）
起始22:218:049:30
排气22:418:239:43
T=121℃22:508:329:50
关闭电源23:108:5210:10
气压降至023:259:0710:16
1.3.2外植体灭菌
①原材料清洗
选择生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株，每2 节为一段放入500ml 的烧杯中，加入少量洗衣粉，用纱布单层棚扎杯口，然后用工程线扎紧，放在自来水龙头下冲洗30min，冲水量调整到能使铁皮石斛茎段在水中漂动为好。

主要作用是洗去外表尘土和大颗粒菌落、菌丝等。

②材料二次消毒灭菌
将上述完成后的材料带到无菌室超净工作台上，进行二次消毒灭菌: 将茎段腋芽的苞叶拨去。

70% 的酒精速浸25s，用0.1%的升汞溶液浸泡10min 用无菌水冲洗5 次，灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底，以去掉表面药物残留。

2.转接
2.1转接前准备
1）培养皿、镊子、剪刀等转接用具的灭菌（可以在培养基灭菌时附带）；
2）检查超净台内各种用具，及时补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；
3）放置待转接材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列；
2.2转接
1）揭去防尘膜，打开电源、通风和紫外灯，灭菌15—20min；
2）关掉紫外，打开白炽灯，用75%酒精仔细擦拭手指、指甲、材料瓶瓶盖及盖边缘、工作区等处，确保“消毒”彻底；
3）点燃酒精灯，用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛的植株用于转接；
4）用无菌剪刀修去多余的根系，“双镊子”法将材料转接于新的培养基中；
5）标注相关日期和品系，转至培养室培养。

注意事项
①操作时，所有用具均不能从“核心工作区”和开启的培养瓶上面晃过，防止细菌落入而导致污染；
②在打开材料瓶和培养瓶后，其盖均在酒精灯外焰灼烧3-5s，瓶口灼烧5-10s；盖瓶盖时，亦如此操作；
③转接时，确保手一直在超净台内，以免带入外界细菌。

2.3培养
石斛组培常用的温度为(26±1) ℃
光强1 600～2 000 lx
日照光8~12h/d
（1）组培苗在光照度为2000lx ，温度以22 ℃为宜。

(2) 在20 一22 ℃时丛生芽增殖较好，温度超过25 ℃丛生芽就开始分化成苗。

待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养。

培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，生根率达到90％以上。

3.炼苗
3.1炼苗目的
炼苗的主要目的是使组培苗适应外界的环境——温差，湿度差以及微生物环境。

3.2炼苗方法
1）将待炼苗的材料放置于欲移栽的环境，不开盖保持4-5天；
2）半开盖保持1-2天后，全开盖再炼苗2-3天；
方法（整个过程：适应期，半开瓶期，开瓶期，出瓶，洗根，浸泡，移栽或框炼并移栽）。

4.移栽
4.1基质选择
栽培的基质为火山岩1+椰衣2+木炭1的基质配比石斛兰长势最好，椰衣1+水苔1和块状椰衣的基质配比稍微次之。

多数树皮中含有较多的酚类物质，这对于植物是有害的，而且树皮的C/N比值都较高，直接使用会引起微生物对速效氮的竞争作用，造成N素缺乏，树皮保水性能差。

4.2移栽技术要求
将已经灭菌地石斛茎段，在无菌条件下切成至少带有一个茎节地茎段，接种于事先准备好的诱导芽培养基中诱导出芽。

从茎尖或茎段培养得到的小苗，大多数是无根小苗，需转入1／2MS加马铃薯进行生根和壮苗培养，才能出管移栽。

铁皮石斛不宜深植，种植时根系向四周均匀展开，将基质填充根部、基部必须露出，否则易造成烂根。

移栽后隔5天再浇水效果较好。

30天内每隔1天喷雾1次，水量不宜过多，期间勿施肥，待小苗恢复正常生长后才开始常规的水肥管理。

4.3移栽后期管理
营养生长期施用氮肥较高的花多多复合肥（N:P:K=30:10:10），花芽分化期开始施偏重磷钾肥（N:P:K=10:30:20），其余时期施（N:P:K=15:20:25）以促进假鳞茎的生长，采用“薄肥多施”的原则，施肥频率为1次／1周，浓度为0.1%叶面喷施，雨天不施肥。

石斛生长季节应注意追肥，每年可追肥两次,第一次在春季,以促进石斛生长,第二次在秋末,既可使石斛储蓄养分,又可使石斛保温过冬。

可用腐熟的花生鼓、菜籽饼、过磷酸钙等加入河泥等混合物撒在根部，此外尚可用0.05—0.1%磷酸二氢钾进行根外追肥。

5.结论与分析
本文以铁皮石斛为材料,通过研究不同基本培养基对铁皮石斛茅诱导和增殖的影响、不同激素浓度组合对原球茎生长影响、天然附加物对铁皮石斛茅增殖的影响、不同浓度NAA对铁皮石斛原球茎增殖的影响,找出适合石斛组织培养快速繁殖的方法及条件,以便更好的用于生产实践。

通过本实验，有助于我们更好地掌握组织培养技术，了解铁皮石斛的组织培养特点。

本试验结果表明：铁皮石斛形成的愈伤组织有群体效益，在培养容器中的分布密度和愈伤组织0.5cm2为宜；铁皮石斛在组培增殖和生根培养过程中需添加土豆汁等辅助物质，才能使组培苗正常生长；铁皮石斛的种子是呈粉状的，从表现性来看无法用肉眼观察出种子的品质好坏，若用种子做外植体进行组培繁育，无法预计培育的后代性状是否优良。

用茎段为外植体建立快繁体系则具有较多的优点（诱导时间短、发生过程简单），在已知母本材料遗传特性的前提下，不存在分化的组织或基本植物结构的丧失，能够较好地保持母本的生物学性状和经济性状。

随着近年来中药产业的蓬勃发展，人们在不断的开发挖掘铁皮石斛药用价值，企业也为提高其经济效益，确保铁皮石斛药材原料基地的建设，盲目地进行规模化产业化生产育苗，而忽视了合理的繁育手段。

一旦建立组培快繁体系，繁育的后代却无法保持亲本良好特性，这样的话前期工作将毁于一旦，还会带来巨大的经济损失，所以在良种选好的前提下需选择能最大极限的保持亲本的特性高效、稳定、经济合理繁育体系来保持铁皮石斛资源达到长期有效地永续利用。

本研究只在铁皮石斛法、遗传稳定性方面做了研究分析，还有待于进行组培苗成年个体差异跟踪调查，组培成品苗药物活性提取及分析等方面进行全面的、更详细的研究。

参考文献
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