实验7-ACE基因多态性分析

溶液Ⅲ 250 μl 重悬沉淀，振荡10秒；（变性）
(NaOH)
转至1.5 ml离心管， 99℃×5min；
加溶液IV 50 μl 振荡5秒；（中和）
(Tris-HCl)
3000g×5min，
上清转移至新0.5 ml离心管，取5 ul用于PCR.
2. PCR反应
• 取消毒的 0.2ml 离心管，加入下列成分：
插入片段
插入型 （I 型 ）
缺失型 （D 型）
490bp
190bp
三、操作步骤
• 基因组DNA抽提 • PCR反应 • 琼脂糖凝胶电泳检测
1. 基因组DNA抽提
溶液Ⅰ 10 ml 漱口20秒 收集漱口水；
(4%蔗糖溶液)
3000g×5min×RT，弃上清；
溶液、实验结果： ACE基因多态性电泳图
2k
1k 750bp 500bp 250bp 100bp
五、注意事项
1. 清洁口腔，充分漱口。 2. 裂解细胞后震荡时间不易长，以免
DNA断裂。
六、思考题
1. 何为基因多态性？ 2. 基因多态性的临床意义有哪些？
• 真核生物基因组中非编码序列多于编码序列
编码序列
基因组
调控序列
非编码序列 重复序列
串联重复序列（串联排列：大卫星、小卫星、微卫星
）
重复单位长度：1-几千bp；重复次数：几次-几百万次
散在重复序列（散在分布：Alu家族）
Alu家族 • 重复单位：300bp左右；130+31+130bp • 具Alu酶切位点 • 30-50万次 • 功能：基因调控 • Alu元件的插入、删除和重组与许多先天性遗传
2×PCR Buffer mix
10 μl
DNA模板
5 μl
引物混合物(10μM each) 2 μl
ddH2O
3 μl
总体系
20 μl
• 扩增程序为：94℃变性 5min
94℃变性30s 55℃复性30s 35个循环 72℃延伸40s
72℃延伸10min, 4℃保存
3. 琼脂糖电泳检测
• 制备1.5％琼脂糖凝胶 • 点样，电泳 • 紫外灯下观察结果
疾病和癌症相关
淋巴细胞染色体 ：绿色为Alu序 列
• ACE基因分析的理论基础 ACE基因第16内含子存在一段长度为287bp（Alu序列）的 插入/缺失（I/D）多态性片段，I/D多态性与血液ACE水平有 明确关系，DD型ACE水平最高，ID次之，II最低。左室肥大 患者中DD型频率明显增高。
• 实验原理 以DNA为模板，ACE基因特异的引物序列位于287bp插入/缺 失片段的两侧进行PCR扩增，故II型扩增片段长度约为 490bp，DD型扩增片段长度约为190bp，ID型扩增片段为２ 个，分别为190bp和490bp。根据PCR扩增片段的大小可进 行多态性分析。
• ACE基因多态性分析 PCR方法分析基因多态性
ACE基因多态性分析 (血管紧张素转换酶, Angiotensin converting enzyme,
ACE)
基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的方 法，从DNA、RNA水平检测基因的存在、结构异常 和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法。
基因多态性：指在一随机婚配的群体中，染色体同 一基因座位点上有两种或两种以上的基因型，它可 决定人体对疾病的易感性、临床表现多样性和对药 物治疗反应的差异性。
颊粘膜上皮细胞 基因组DNA的抽提 及ACE基因多态性分析
李姣 生物化学与分子生物学教研室 同济大学医学院再生医学系 Email:07085@
基因组DNA来源：颊粘膜上皮细胞
二、实验原理
• 基因组DNA抽提 碱裂解法抽提基因组DNA（本实验） 用蛋白酶K和苯酚提取大分子DNA 裂解-蛋白酶K-沉淀法快速提取DNA