重组蛋白的表达系统(详细版) PPT

• 终止子： • 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作
用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有 一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA 在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此 提高重组蛋白的表源自文库量。但是对于T7系统来说， 由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有 充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中 表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子， 只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需 要终止子。 • 启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中 有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真 核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的 基因的高效表达。
导致的目的基因转录，从而降低重组蛋白的本底表达水平。 • P突在L、变42c体s℃p菌A时启株诱动中导子，重使P组L等宿蛋启主白动菌表子能达使够；得进c宿行sp主温A启在度动3依0子℃赖则时型被抑的高制表温重达（组。3蛋在7℃白温）表度抑达敏制，感，而型
低温（10℃）启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低 了使用成本，同时也降低了诱导剂对细胞的伤害。
典的lac启动子。 • 强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达
到细胞总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿
拉伯糖，本底表达量低，启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达
系统中最高效的启动子，pET表达系统即是以它为中心构建的。T7启 动子来源于λ噬菌体，专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合 在宿主菌的基因组中。在λ噬菌体溶源的表达宿主菌，如BL21（DE3）
• 融合标签： • 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组
标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本 身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也 不必引入标签。 • 融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、 pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。 • His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0）， 免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。 • 如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮 助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困 难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白 产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。 • 标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮 助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度， 对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签； C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中 心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免 影响重组蛋白的结构和功能。 • 如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要 有件三苛种刻方（法羟：胺化需学要裂在解pH，9.如0下溴反化应氰）（，CN特Br异）性、较羟差胺，（而N且H2O会H）引等入，不能必够要简的单修有饰效，地除去包除含标体签蛋，白但的反处应理条外 已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的 方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该 质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性， 使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。
重组蛋白的表达系统(详细版)
一、 原核表达系统
• 原核表达系统发展完善、流程简单快速、 成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值 得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及 不需要翻译后修饰的真核蛋白。
1.1 表达菌株
表2 常用E. coli表达菌株
1.2 质粒载体
• 启动子：
• 表达重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强弱、 作用方式、调控方式和本底表达水平。表达载 体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动 子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表 达、表达小量伴侣蛋白等。按照作用方式，启 动子可以分为两类：组成型表达的启动子使宿 主不停地表达重组蛋白，常用于工业生产，如 σS等；诱导型表达的启动子使宿主仅在受到 诱导（诱导剂、温度等）时表达目的蛋白，诱 导型启动子使重组蛋白的表达容易控制，同时 降低了外源蛋白对细菌生长的影响。
图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
• 早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个
弱启动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共 表达的蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经
中，lacI抑制T7 RNA聚合酶的表达，IPTG的加入可以解除这种抑制。
当受到诱导时，T7 RNA聚合酶开始表达并结合在T7启动子上，启动重 组蛋白的表达。T7 RNA聚合酶活性很高，转录速度比大肠杆菌RNA聚 合酶快5倍，使其下游的重组蛋白得到高效表达，其产率可以达到细
菌总蛋白量的50%以上。T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一个 lac操纵子，其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列。 lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻断T7 RNA聚合酶