植物组织细胞培养生产紫杉醇的研究进展分析

步骤：
悬浮培养
继代
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悬浮细胞培养
• 只有当愈伤组织经过长时期固体培养,表现出相当 的生理稳定性后,才能进行悬浮培养。一般采用B5 培养基，碳源多为蔗糖。 温度、接种量、光照强度，pH值等的改变均能影 响细胞的生长率和产物合成
加入培养基 • 半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液， 同时补充加入等量的新鲜培养液 • 连续培养：连续收获细胞，同时不断补充培养液
提高紫杉醇产量的方法
前体饲喂
添加诱导因子
添加抑制剂 筛选细胞株系
前体饲喂
• 一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高 产率 • 另一方面能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利 进行,有效提高紫杉醇产量。 • 常用：苯甲酸，苯甲酰甘氨酸
添加抑制剂
• 添加抑制剂能够反馈抑制分支路径而使反应向有 利于紫杉醇合成的方向进行。 • 发现合成代谢抑制剂氯化胆碱CCC可以使紫杉醇 含量提高，但浓度过高却抑制合成。
• ⑥现今又有一种新的培养高产细胞系的方法,即利 用秋水仙素诱导建立四倍体红豆杉细胞系,实验证 明,产量是普通二倍体的3.85倍.[13]
参考文献
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排出培养基及其培养 物
紫衫细胞大量培养
• 前期利用碳水化合物的选择加快细胞生长,使细胞 量迅速增加。达到一定细胞量后,改用利于紫杉醇 合成的培养液。通过调整合成培养液的组成,延长 紫杉醇合成时间（静止期）。 • 为了提高生产率，需要提高活性细胞浓度，大规 模地培养红豆杉细胞。现在已经发展了不少大规 模培养系统，同时使用固定化的细胞，原位提取 等现代发酵技术方法能够在一定程度上提高活性 细胞的浓度。
细胞克隆技术筛选
• 目前，主要运用现代生物基因工程的方法来获得高产 细胞系
问题与前景
①红豆杉属植物组织细胞培养中的褐化现像，尚无 良好的解决办法【8】 ②紫杉醇本身是一种细胞生长的毒性物质,其量的 积累愈多,对细胞增殖的抑制越强.,即使添加真菌 诱导子及生物合成前体,组织细胞培养生产紫杉醇 也难以达到产业化应用水平【10】,
添加诱导子
• 紫杉醇是一种植物防卫素，可以被诱导 • 茉莉酸甲酯----参与植物防御信号的转导与放大
• 花生四烯酸----浓度为5µ g/g时即可将紫杉醇含量 提高9.3倍,与茉莉酸甲酯表现出明显的诱导协同 作用。
筛选出高产的细胞株系
• • 紫杉醇含量 • 高的外植体 • • 诱导
愈伤组织
变异
高产细胞 植株
植物组织培养
• • • • 愈伤组织培养 继代培养 悬浮细胞培养 紫衫细胞大量培养
愈伤组织培养
• • • • 选择合适的外植体：以幼茎为佳 除去病原菌和杂菌：处理外植体 配置合适的培养基。 诱导及培养：将上述小块组织接种于MS培养基中， 于25 ℃的二氧化碳培养箱中培养40天。PH5.8， 诱导和分化，即可形成小的愈伤组织块
继代培养
• 愈伤组织长出后经过4~6周的迅速细胞分裂，原 有培养基的水分和营养成分多以耗失有害代谢产 物已在培养基中积累，必须移植。即是继代 • 愈伤组织也易分泌橙红色色素或发生褐化，使生 长速度减慢，甚至死亡（这是愈伤组织分泌的酚 类物质被氧化成醌类物质造成的）。
*缓解褐化
• 在培养基中加入还原剂或吸收酚类的物质, 可以减 少致死现象,保持愈伤组织的生长活性。 • 如：半胱氨酸、维生素C、活性炭 • PS：由于吸附剂对营养物质和激素的吸收,较高浓 度的吸附剂会部分地抑制愈伤组织的生长
获取紫杉醇的途径
• • • • 化学合成 红豆杉中提取 真菌发酵 植物组织培养
化学合成
1.全合成： 路线复杂，反应条件难以控制，产率低， 用到剧毒原料，仅限于实验室水平
2.半合成： 国外专利技术壁垒，国内生产附加值低
红豆杉中直接提取
• 资源匮乏红豆杉生长缓慢， 树皮剥取后不能再生， 树木将死去
③细胞培养物生长速度慢,有效物质含量低、成本 高、大规模生产技术尚未过关【9】 ④添加诱导因子，在一段时间内可以增加紫杉醇产 量，但随着细胞的遗传，会逐渐产生抗性，是产 量降低，这也是无法工业化生产的一大原因。
• ⑤紫杉醇作为一种抗有丝分裂机制，在有丝分裂 过程中，干扰了细胞的正常分裂，使红豆杉细胞 染色体数目极易发生变化,红豆杉中紫杉醇的含量 极不稳定，因此稳定的保存并筛选高产的紫杉醇 细胞系显得尤为重要。
植物组织细胞培养生产紫杉醇的 研究进展
背景介绍
• 紫杉醇是红豆杉属植物中的 一种复杂的次生代谢产物, 也是目前所了解的惟一 一种可以促进微管聚合和 稳定已聚合微管的药物。
药理
• 细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管， 这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使 细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常 分裂。 • 通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌 和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部 癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。
• 紫杉醇在植物体内含量极低， 最多0.069% • 需多步柱分离技术，生产成本高
真菌发酵
• 真菌发酵生产紫杉醇因真菌的紫杉醇含量仅有植 物细胞的十万分之一,离生产的距离太远。
• 从长远来看,植物组织培养才是解决紫杉醇供需矛 盾的最佳途径。
组织培养
• 组织培养是在无菌和人为控制外因（营养成分、 光、温、湿）的条件下，培养和研究植物组织、 器官，甚至进而从中分化、发育 出整体植株的技 术。