【精选】第五章种子扩大培养

二、生产车间种子制备
以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做 种子，经种子罐扩大培养后，满足发酵罐对 种子的要求。
种子罐培养原则：
采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐 等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
摇瓶菌丝体种子： 可在火焰保护下接入种子罐或 采用压差法接入。
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
种子罐级数的意义：
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并可减少移种带来染菌机会。
但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时 间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时 间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数 不宜过少。
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32℃，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶
液体培养基，32℃培养12h，即可作种子罐种子。 例如：谷氨酸棒状杆菌。
（3）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中， 就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率， 并且也有利于减少染菌的机会。
（4）对于不同产品的发酵过程来说，必须根 据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子 扩大培养的级数。
种子液(几或几十立方米)
按10%接种量
发酵罐(几十或几百立方米)
由实验室制备到车间生产 的过程
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
一、 实验室种子制备
保藏在沙土管、冷冻干燥管或斜面上的菌 种经无菌操作接入适合于孢子发芽或者营养体 生长的斜面培养基上，经培养成熟后挑选正常 的孢子或营养菌体再一次接入试管斜面反复培 养几代。
这一阶段也称为活化，目的是使保藏的 菌种达到正常稳定的生长代谢速度。
例如：青霉素孢子悬液接入一级种子罐 （发芽罐）于27℃培养40h，孢子发芽，长 出短菌丝。再移至第二级种子罐（繁殖 罐），27℃培养10-24h，菌丝迅速繁殖， 获粗壮菌体，即可移至发酵罐，这称为二 级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般 50m3发酵罐都采用三级发酵。
3.生长更慢的菌种
链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用 三级种子罐扩大培养。
种子质量的优劣对发酵生产起关键作用。其生产方 法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。
作为种子的要求：
1)、菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短 2)、生理性状稳定 3)、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 4)、无杂菌污染 5)、保持稳定的生产能力
菌种的培养方法：
固体培养法 液体培养法(两类）
种子扩大培养的原因 工业生产规模的增大 种子的扩大培养
需要种子就增多
种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的 培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数 量足够的、纯的培养物。
菌种的活化与种子的扩大培养的区别？
菌种扩大培养小结
（1）为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺 盛的种子。
（2）发酵时间的长短与接种量的大小有关， 接种量大，发酵时间则或MYPG培养基的斜面 上，4℃冰箱保存.每年移种3-4次。
斜面菌种→接入含10mL麦芽汁试管→25-27℃培养23d→扩大至三角瓶→25℃培养2d→移至含5-10L麦芽汁的 罐→15-20℃培养3-5d→含100L麦芽汁的发酵罐。
MYPG培养基：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨, 10g葡萄糖,20g琼脂,1L水。
斜面活化的菌种进一步扩大培养，根据 菌种特性的不同可采用不同的培养方法。
A、砂土管或冷冻干燥管菌种活化
接入斜面/平板，培养成熟后，挑选孢子，再一次接 入斜面/平板，进行活化。(两次转接)
B、产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种
可采用固体培养基培养孢子，直接作为种子罐的种子。
举例:产黄青霉菌，采用大米或小米为固体培养基，装入 摇瓶、灭菌，要注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接 入孢子，25-28℃培养14d。培养结束，将孢子瓶于真空下抽 去水分，使含水量10％以下，冰箱保存备用。
种子罐之间或发酵罐间的移种：
主要采用压差法，由种子接种管道 进行移种，移种过程中要防止接受 罐表压降至零.
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种子罐的作 用？
A 种子罐级数的确定
菌种是如何分级 的呢？
种子罐级数指制备种子需扩大培养的次数.
种子制备的工艺过程中，因菌种不 同，一般可以分为一级种子、二级种子 和三级种子。
种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌 体生长速度、产物品种、生产规模及发酵设备 的合理利用率。
种子罐级数随菌种及规模而定，也与工艺条 件有关。
优化种子罐培养条件，加速孢子发芽及菌体 繁殖，也可减少种子罐的级数。
1、生长快的细菌，种子用量少，种 子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，菌接入种子罐 32℃培养7-10h，即可接入发酵罐作为种 子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二 级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种 子罐相应也多。
在小型发酵罐(5—30L)进行试验时，也有 采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵，称 一级发酵。
第二节 影响种子质量的因素
影响种子质量的因素 种子质量的判断 种子质量的控制
一、种子质量标准
作为种子的质量准则：
1)、菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短 2)、生理性状稳定 3)、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 4)、无杂菌污染 5)、保持稳定的生产能力
种子扩大培养
15L种子发酵罐
300L啤酒发酵罐
第一节 种子制备工艺
实验室准备阶段
生
产
车
间
阶
放罐，后处理
段
产品
种子扩大培养概念：
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥 管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化 后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而 获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养 物称为种子。