植物体细胞杂交
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杂种细胞
（植物体细胞 融合完成的标 志）
细胞分裂 脱分化
愈伤组织
再分化
植物 组织 培养
杂种植株
植物体细胞杂交
植物细胞A
植物细胞B
怎样才能去除细胞 去壁 壁但又不破坏细胞
酶解法
的生命活性呢？ 原生质体A 酶的
融物理合方的法原：离理心及、常振荡用、电刺激
专一性
去壁 原生质体B
生物膜的
植 物 细 胞
的化学融方合法方：聚法乙？二醇（PEG）
❖ 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂 种，这是第一个植物体细胞杂种；
❖ 1974年，Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物 细胞融合并建立了相应的融合技术；
❖ 1978年，Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄＋ 马铃薯）；
❖ 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电 融合概念；
细胞融合流程 细胞融合的方法及步骤
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
化学方法
聚乙二醇 PEG） NaNO3处理
高PH-高浓度Ga2+
物理方法
电脉冲
飞秒激光诱导融合
电融合芯片 空间细胞融合
生物方法
仙台病毒 (Sendai virus)
原生质体融合的有关名词
❖ 对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%） ❖ 非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）
❖供-受体融合：Donor-recipient fusion ❖体配融合（gameto-somatic fusion）（性细
胞与体细胞融合） ❖ 亚原生质体-原生质体融合：
Subprotoplast-protoplast fusion ❖ 小原生质体：Miniprotoplast ❖ 微原生质体：Microprotoplast ❖ 胞质体：Cytoplast ❖胞质体-原生质体融合: Cytoplast-protoplast
❖ 这些药剂可使正在分裂的植物细胞停留在有丝分裂中期，数小时后， 染色体解开螺旋，形成内含多个微原生质体的微核化细胞，每个微原 生质体内含有一条或几条染色体，由于有丝分裂停留在中期，每条染 色体的两个姐妹染色单体仍在一起，着丝点不分开。通过酶解去掉微 核化细胞的细胞壁获得微核化原生质体，再用离心等技术分离出带有 一条或几条染色体的微原生质体，诱导其与完整的受体原生质体融合 ，从而实现部分基因组的转移。
fusion
微原生质体融合
❖ 植物微原生质体融合是在此基础上发展起来的将一种植物的一条或
几条染色体转移到另一种植物中的新的非对称原生质体融合的方法。 其原理是采用适当浓度的微核诱导剂，包含DNA合成抑制剂和纺锤体 毒素两大类，常用的如秋水仙素(COL)、安磺灵(oryzalin)、草胺 磷除草剂(eremart)、甲基氨草磷(ApM)、甲氨喋吟(MTx)、氯苯 胺灵(CIPC)等。
❖融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制 的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有 效途径。
❖体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外 遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶 绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的 核外遗传系统。
体细胞杂交与有性杂交的异同
比较内容
时间
体细胞杂交
有性杂交
❖ 80年代初，由模式植物转向农作物/经济作物， 对称融合到非对称融合，创造新种质的技术手段
❖ 80年代末，大量木本植物细胞融合成功的报道 ❖ 90年代至今，成为一种育种手段
植物体细胞杂交的几个重要进展
❖ 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得 成功；
❖ 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再 生完整植株；
无季节限制
花期限制，特别是母 本的花期
亲缘关系
一定程度上可以克服 有性/嫁接不亲和性
受亲和性影响
结果
细胞核、细胞质均可 双受精，一般无细胞 以重组、倍性增加 质重组，倍性不改变
几种不同的表述：
体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion 无性杂交：asexual hybridization 超性杂交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 细胞操作：Cell manipulation 细胞工程（Cell engineering）
体细胞杂交步骤：
1 原生质体的制备 2 原生质体的融合 3 杂种细胞选择 4 杂种细胞培养 5 由愈伤组织再生植株 6 杂种植株的鉴定
植物体细胞杂交技术的过程：
杂交的两个细胞
用纤维素酶、果胶酶处
植
理细胞壁
物
细
原生质体Ａ、Ｂ
胞
经离心、振 用聚二乙醇
融
动、电刺激 （ＰＥＧ）
合
诱导
融合后的原生质体
再生细胞壁
❖ 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程 序。
体细胞杂交的一般概念
❖ 体细胞杂交，即原生质体融合，将两个 不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并 培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交 （A + B）。
根据概念，在理论上任何细胞都可能通过体细 胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的 开发和利用具有深远的意义。
主要内容
我们从以下几方面来探讨植物体细胞杂交技术。
1 体细胞杂交研究历程及一般概念 2 体细胞杂交的一般流程 3 杂交细胞的鉴定及相关应用领域 4 细胞杂交的相关文献
发展历程
❖ 70年代，技术建立和完善优化 ▪ 1972年获得烟草种间体细胞杂种 ▪ 1975年高Ca高pH加PEG融合方法，电融合法 ▪ 大量成功报道，不少为异想天开的实验
融合 流动性
融
融合可能的类型？
融合的原生质体
合
怎 植样物筛体选细杂胞种杂细交胞成？功的 AB
再生细胞壁
标杂志交是细什胞么的？筛选
杂种细胞AB
植
利用杂种细胞获得杂种 植株所依据的原理？
获杂得种的植杂株种的植鉴株定是否能表
脱分化 愈伤组织
再分化 杂种植株
植物 细胞 具全 能性
物 组 织 培 养
现出人们所期望的性状？
▪ 胞质杂种（cytoplasmic hybrid, Cybrid）：细胞质重 组，细胞核未重组
❖ 对称融合（symmetric fusion） ❖ 也称标准融合（Standard fusion） ❖ 非对称融合（asymmetric fusion）：融合前对一方进
行处理，使其染色体丢失一部分
原生质体融合的有关名词-II
（植物体细胞 融合完成的标 志）
细胞分裂 脱分化
愈伤组织
再分化
植物 组织 培养
杂种植株
植物体细胞杂交
植物细胞A
植物细胞B
怎样才能去除细胞 去壁 壁但又不破坏细胞
酶解法
的生命活性呢？ 原生质体A 酶的
融物理合方的法原：离理心及、常振荡用、电刺激
专一性
去壁 原生质体B
生物膜的
植 物 细 胞
的化学融方合法方：聚法乙？二醇（PEG）
❖ 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂 种，这是第一个植物体细胞杂种；
❖ 1974年，Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物 细胞融合并建立了相应的融合技术；
❖ 1978年，Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄＋ 马铃薯）；
❖ 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电 融合概念；
细胞融合流程 细胞融合的方法及步骤
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
化学方法
聚乙二醇 PEG） NaNO3处理
高PH-高浓度Ga2+
物理方法
电脉冲
飞秒激光诱导融合
电融合芯片 空间细胞融合
生物方法
仙台病毒 (Sendai virus)
原生质体融合的有关名词
❖ 对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%） ❖ 非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）
❖供-受体融合：Donor-recipient fusion ❖体配融合（gameto-somatic fusion）（性细
胞与体细胞融合） ❖ 亚原生质体-原生质体融合：
Subprotoplast-protoplast fusion ❖ 小原生质体：Miniprotoplast ❖ 微原生质体：Microprotoplast ❖ 胞质体：Cytoplast ❖胞质体-原生质体融合: Cytoplast-protoplast
❖ 这些药剂可使正在分裂的植物细胞停留在有丝分裂中期，数小时后， 染色体解开螺旋，形成内含多个微原生质体的微核化细胞，每个微原 生质体内含有一条或几条染色体，由于有丝分裂停留在中期，每条染 色体的两个姐妹染色单体仍在一起，着丝点不分开。通过酶解去掉微 核化细胞的细胞壁获得微核化原生质体，再用离心等技术分离出带有 一条或几条染色体的微原生质体，诱导其与完整的受体原生质体融合 ，从而实现部分基因组的转移。
fusion
微原生质体融合
❖ 植物微原生质体融合是在此基础上发展起来的将一种植物的一条或
几条染色体转移到另一种植物中的新的非对称原生质体融合的方法。 其原理是采用适当浓度的微核诱导剂，包含DNA合成抑制剂和纺锤体 毒素两大类，常用的如秋水仙素(COL)、安磺灵(oryzalin)、草胺 磷除草剂(eremart)、甲基氨草磷(ApM)、甲氨喋吟(MTx)、氯苯 胺灵(CIPC)等。
❖融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制 的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有 效途径。
❖体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外 遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶 绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的 核外遗传系统。
体细胞杂交与有性杂交的异同
比较内容
时间
体细胞杂交
有性杂交
❖ 80年代初，由模式植物转向农作物/经济作物， 对称融合到非对称融合，创造新种质的技术手段
❖ 80年代末，大量木本植物细胞融合成功的报道 ❖ 90年代至今，成为一种育种手段
植物体细胞杂交的几个重要进展
❖ 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得 成功；
❖ 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再 生完整植株；
无季节限制
花期限制，特别是母 本的花期
亲缘关系
一定程度上可以克服 有性/嫁接不亲和性
受亲和性影响
结果
细胞核、细胞质均可 双受精，一般无细胞 以重组、倍性增加 质重组，倍性不改变
几种不同的表述：
体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion 无性杂交：asexual hybridization 超性杂交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 细胞操作：Cell manipulation 细胞工程（Cell engineering）
体细胞杂交步骤：
1 原生质体的制备 2 原生质体的融合 3 杂种细胞选择 4 杂种细胞培养 5 由愈伤组织再生植株 6 杂种植株的鉴定
植物体细胞杂交技术的过程：
杂交的两个细胞
用纤维素酶、果胶酶处
植
理细胞壁
物
细
原生质体Ａ、Ｂ
胞
经离心、振 用聚二乙醇
融
动、电刺激 （ＰＥＧ）
合
诱导
融合后的原生质体
再生细胞壁
❖ 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程 序。
体细胞杂交的一般概念
❖ 体细胞杂交，即原生质体融合，将两个 不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并 培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交 （A + B）。
根据概念，在理论上任何细胞都可能通过体细 胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的 开发和利用具有深远的意义。
主要内容
我们从以下几方面来探讨植物体细胞杂交技术。
1 体细胞杂交研究历程及一般概念 2 体细胞杂交的一般流程 3 杂交细胞的鉴定及相关应用领域 4 细胞杂交的相关文献
发展历程
❖ 70年代，技术建立和完善优化 ▪ 1972年获得烟草种间体细胞杂种 ▪ 1975年高Ca高pH加PEG融合方法，电融合法 ▪ 大量成功报道，不少为异想天开的实验
融合 流动性
融
融合可能的类型？
融合的原生质体
合
怎 植样物筛体选细杂胞种杂细交胞成？功的 AB
再生细胞壁
标杂志交是细什胞么的？筛选
杂种细胞AB
植
利用杂种细胞获得杂种 植株所依据的原理？
获杂得种的植杂株种的植鉴株定是否能表
脱分化 愈伤组织
再分化 杂种植株
植物 细胞 具全 能性
物 组 织 培 养
现出人们所期望的性状？
▪ 胞质杂种（cytoplasmic hybrid, Cybrid）：细胞质重 组，细胞核未重组
❖ 对称融合（symmetric fusion） ❖ 也称标准融合（Standard fusion） ❖ 非对称融合（asymmetric fusion）：融合前对一方进
行处理，使其染色体丢失一部分
原生质体融合的有关名词-II