临床研究方法课题申请书

扬州大学

大学生创新创业训练计划项目/学术科技创新基金项目

申报表

推荐学院：扬州大学医学院（盖章）

项目名称：叶酸相关基因多态与唐氏综合征的关系的研究

项目类别：

□社哲论文及调查报告□文史体艺设计等

所属一级学科名称：基础医学

项目负责人：秦佳睿

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指导教师：武辉

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填表日期： 2016 年 12 月 5 日

一、申请理由

1、成员为大四学生，已经学习过医学遗传学学科，已掌握基本的实验技术与方法，具备基本的实验素养，能比较独立地完成科研项目。

2、小组成员热爱探索，坚持不懈，思考灵活，不怕困难，在知识和挑战面前永不退缩，能够很好得完成课题研究。

3、组员对遗传学以及21三体综合征有着浓厚的兴趣，并希望在此方面有自己的研究历程和成果，为以后走向临床积累经验。

二、项目方案

1、项目研究背景、研究现状及研究意义

James【1】等提出，叶酸代谢障碍和DNA低甲基化可能增加染色体减数分裂不分离的风险，并经初步研究证实出生过DS患儿的母亲有不正常的叶酸代谢与DNA低甲基化，其血浆中有轻度升高的HCY水平和MTHFR基因677位点的C→G 多态。Rosenblatt【2】等的研究也表明，叶酸与HCY代谢障碍及相关基因多态和DS的发生有关。Hobbs【3】等报道蛋氨酸合成酶还原酶基因A66G多态也可能与DS发生有关，同时有MTHFR和MTRR纯合变异的母亲分娩DS患儿危险性增加了倍，因此MTRR市目前发现的叶酸代谢途径中第二个与DS有关的基因。Hassold 【4】等研究表明MTHFR与MTRR多态，除与DS发生有关外，也与18三体相关，而与其他的染色体三体的发生无明显相关性。

近年对MTHFR基因相关的多态性研究，除677C/T多态外，发现另外5个有关位点的多态分别为1298A/C、1084C/T、1711C/T、983A/G、1027T/G，但这些位点的多态与DS发生关系的研究未见文献报道。由于上述基因多态的分布在种族、地域中变异频率差异较大【5-6】，且与DS发生相关性的研究在不同种族中报道也有差异【7】。本研究选择分娩过DS患儿的母亲，对其进行MTHFR两个位点677和1298与MTRR基因66位点多态性分析，与相应对照组进行比较，以了解中国汉族女性中上述MTHFR基因及MTRR基因多态与DS发生的关系，即可能对染色体减数分裂不分离的影响，同时选择通过传统的二联筛查，筛查出DS高危孕妇与相应对照组的孕妇进行MTHFR基因677位点基因型的分析，为今后对育龄妇女进行孕前叶酸代谢相关基因多态性筛查及DS综合征的叶酸预防提供依据。

参考文献

【1】James SJ,Pogribna M,Pogribny IP, et al. Abnormol folate metabolism and mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene may be maternal risk factors for Down syndrome [J]. Am J Clin Nutr,1999,70(4):495-501.

【2】 and homocysteine and gene polymorphisms in the etiology of Down syndrome[J]. Am J Clin Nutr,1999,70(4):429-430.

【3】Hobbs CA, Sherman SL,YI P,et in genes involved in folate metabolism as maternal risk factors for Down syndrome[J].Am J Hum Genet,2000,67(3):623-630.

【4】Terry J,Hassold,Lindsay C,et folate polymorphisms and the etiology of human nondisjunction[J].Am J Hum Genet,2001,69:434-439.

【5】Lorenzo D,Botto LD,Yang Q. 5,10-methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Variants and Congenitial Anomalies: A Huge Review[J]. Am J Epidemiol,2000,151(9):862-877.

【6】Rady PL, Szucs S,Grady J,et polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase and methionine synthase reductase in ehhnic populations in Texas:a report of a novel MTHFR polymorphic site,G179A[J]. Am J Med ,107(2):162-168.

【7】Chango A,Fillon-Emerry N,Micher C,et asssociaion between common polymorphisms in genes of folate and homocysteine metabolism and the risk of Down’s syndrome among French mothers[J].Br J Nutr,2005,94(2):166-169.

2、项目研究目标、研究内容和拟解决的问题

研究目标：

酸代谢中的关键性酶：亚甲基四氢叶酸还原(Methylenetetrahydrofolate reductase)基因677C/T、1298A/C及蛋氨酸合成酶还原酶(Methionine Synthase Reductase，MTRR)基因66A/G的遗传多态性是否与唐氏综合征(Down syndrome，DS)的发生相关。

研究内容：

100例生育过DS患儿的汉族母亲为病例1组，100例相匹配的汉族母亲为对照1组，使用PCR-RFLP和MGB-Taqman实时PCR方法检测MTHFR 677，MTHFR 1298，MTRR 66的基因型，化学发光法检测血浆中同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)的水平。选择100例通过二联筛查（检测孕妇血清中的甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺β亚基作为DS筛查的指标）筛查出的DS高危孕妇为病例2组，100例正常的单胎孕妇为对照2组，进行MTHFR677基因检测，以提高筛查实验的特异性和灵敏性。

拟解决的问题:

1、MTHFR 677C/T、MTHFR 1298A/C、MTRR 66A/G的多态是否可以增加生育DS 患儿的风险。

2、DS发生是否存在基因间的协同作用。

3、HCY的代谢异常是否可以显着增高生育DS患儿的风险。

4、结合叶酸/HCY代谢相关基因多态性的检测和二联筛查，能否提高产前筛查试验的灵敏性和特异性。

3、项目创新特色概述

传统的TaqMan荧光探针是在ＰＣＲ扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和淬灭荧光基团。本实验采用的荧光探针是一种新型TaqMan-MGB探针，与传统的TaqMan探针相比，有以下优势：（1）可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列的MGB探针的设计有很大的帮助。（2）提高配对与非配对模板间的Tm 值差异。（3）由于在探针的3’端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更