重组质粒的构建

重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
崔文强201300140012
同组者：陈斌，郝书平【摘要】
重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。

这就需要正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

然后利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA分子。

接着将外源重组DNA引入受体细胞，所以首先要用CaCl2法制备感受态细胞，通过复制和表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状，再用红白斑筛选重组子，最后检验导入片段的大小。

本次实验涉及的操作方法有很多，比如利用CaCl2制备感受态细胞的方法、热击法转化E.coli的方法、重组DNA分子鉴定的基本方法、用试剂盒提取重组质粒DNA的方法和琼脂糖凝胶电泳的方法等等。

【关键词】
重组质粒；限制性内切酶；DNA连接酶；感受态细胞；红白斑筛选；琼脂糖凝胶电泳
【引文】
外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。

重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。

将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳检验的方法进行重组子的鉴定。

本实验采用单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。

选择具有相同限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。

重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。

因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转
化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。

还有需要注意的一点是质粒不亲和：在没有选择压力的情况下，两种亲缘密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。

【正文】
1、实验材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验器材
Eppendorf管，枪尖，枪尖盒，微量移液器，制冰机，灭菌锅，恒温水浴锅，高速离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶成像检测仪，微
波炉，恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，计时器，平板，三角瓶，
试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴。

1.1.2实验试剂
琼脂糖，λDNA，质粒pUC19，Hin dIII，10×M buffer，去离子水，溴酚蓝电泳上样缓冲液，TAE电泳缓冲液，氨苄青霉素母液，
100mmol/LCaCl2溶液，试剂盒（含有RNase A的溶液I，溶液II，溶
液III，HB buffer，DNA washing buffer，elution buffer），EB染液。

1.1.3菌株
E.coli DH5α
1.1.4培养基
LB培养基，麦康凯培养基
1.2实验方法
1.2.1限制性核酸内切酶及酶切反应
在0.5mLEppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分。

各管样品混合均匀后，4000rpm，1min，将液体集中于管底。

37℃，1-2h，
电泳检测酶切效率。

表1限制性核酸内切酶酶切反应体系
加样序号成分pUC19
（各组）
体积（μ
L）
λDNA
（商品）
体积（μ
L）
pUC19
（商品）
体积（μ
L）
1 ddH2O 11.0 55.0 64.0
2 10×M
buffer
2.0 7.5 8.0
3 DNA 6.0 10.0 4.0
4 HindIII 1.0 3.0 4.0
共计20.0 75.0(50+2
5)
80.0(50+ 30)
备注1 各组一
份
全班一份全班一份
备注2 注意
DNA加量：
多：杂质影
响；少：载体
量少；在二者
之间求得平
衡
λDNA浓
度0.35μg/μ
L
pUC19浓
度0.5μg/μL
表2酶切后琼脂糖凝胶电泳上样顺序
泳道1 2 3 4 5 6 7 …
…
1
5
样品
λ
/HIII
λ
DNA
λ
/HIII
（Tes
t）
pU
C19（商
品）
pU
C19（商
品）/HIII
p
UC19(
商品）
/HIII
pU
C19/HII
I
D
L500
上样量（μL）5 5 6
.0
5 5 5 10
.0
5
作用M 对
照
T 对
照
对
照
T 1
组
m
arker
1.2.2载体与外源DNA的连接反应
在Eppendorf管中依次加入连接反应所需的各种成分。

各管样品混合均匀后，4000rpm，1min，将液体集中于管底。

在16℃的恒温过
夜培养。

表3连接反应体系
加样
序号
1 2 3 4 5
成分dd
H2O
10×
T4ligaseBuffe
r
酶切后
的pUC19
酶切
后的λ
DNA
10×
T4DNALiga
se
加样
量（μL）
3.2 1.0 1.5 3.5 0.8
1.2.3感受态细胞的制备及质粒转化
受体菌培养
（1）固-液接种：从LB平板上挑取新活化的
E.coliDH5α单菌落，接种于5mLLB培养基中，37℃振荡培
养过夜。

（2）液-液转接：以1%接种量将过夜培养的
E.coliDH5α接种于新鲜LB培养基中，37℃，220rpm振荡培
养2-2.5h。

（3）菌液冰浴：2-2.5h后，将菌液置于冰浴中。

感受态细胞的制备
（1）取两个无菌的1.5mLEp管，各加入1.5mL菌液（倒满为止），4℃，4000rpm离心5min，弃上清。

重复
上述操作，使每个Ep管中收集3mL培养液的菌体。

（2）残留液体涡旋细胞，加800μL预冷的
0.1MCaCl2，冰浴悬浮细胞。

4℃，4000rpm离心5min，弃
上清。

（3）加入100μL预冷的0.1MCaCl2，轻轻悬浮细胞，分装成三管：100μL*1+50μL*2，冰浴20min。

感受
态细胞制备完成（现用或者48h内使用，4度保存）。

感受态细胞的转化
（1）取新配制的感受态细胞悬液加样
I-实验组：感受态细胞悬液100μL+连接物5.0μL；
II-转化对照组：感受态细胞悬液50μL+pUC19 1.0μL；
III-细胞对照组：感受态细胞悬50μL。

（2）将以上各样品管轻轻摇匀，冰浴20min后于42℃水浴保温90s，然后迅速置于冰上冰浴3min。

（3）复苏：向上述各管中分别加入新鲜LB培养基900μL，摇匀，于37℃复苏培养0.5-1h，使受体菌恢复
正常生长。

稀释和涂布平板
（1）将转化细胞溶液按以下操作涂布平板：
I-实验转化组：取50、100、150和200μL培养液涂布在2个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上。

II-转化对照组：取50μL培养液涂布在1个含氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上。

III-细胞对照组：取50μL培养液分别涂布在含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上。

（2）当菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37℃恒温培养16-20h。

表4重组质粒及转化对照参考表
步骤：
1-7
1 2 3 4 5 6 7
实验设组感受态细
胞（μL/
管）
DNA
（μL）
冰
浴
热
击
冰浴复苏培养基涂布平板
I-实验转化组100 连接物
5.0
10
min
90s 5
min
LB：
0.9mL
/管，
0.5-1h
麦+Ap 50μL*2
100μL*2
150μL*2
200μL*2
II-转化对照组50 pUC19
1.0（自
提
麦+Ap 50μL*1
III-细胞对照组50 麦+Ap 50μL*1
麦50μL*1
1.2.4重组转化子的筛选与验证
观察平板上有无菌落生长、菌落与平板颜色以及菌落数量。

从含有氨苄青霉素的麦康凯平板上挑取8个白色菌落划线于空白含氨苄
青霉素的麦康凯平板上，于37℃恒温培养16-20h。

挑取该平板上的
白色菌落于20mLLB培养基中，37℃恒温培养过夜。

1.2.5重组质粒的提取（试剂盒法）与电泳检测
1、将带有质粒的E.coli接种于5mLLB/抗生素培养液中，37℃
摇床培养12-16h。

2、取1.5mL的菌液，室温下13000r/m离心1min收集细菌。

3、倒弃培养基，加入250μLSolutionⅠ/RNaseA混合液，漩涡震荡使细胞完全悬浮。

4、往重悬混合液中加入250μLSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀4-6次，此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过5min。

5、加入250μLSolutionⅢ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。

6、室温下，13000r/min离心10min。

7、转移上清液至套有2mL收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下，13000r/min离心1min，倒去收集管中的滤液。

8、把柱子重新装回收集管，加入500μLHBBuffer，按上述条件离心，弃去滤液。

9、把柱子重新装回收集管，加入700μLDNAWashBuffer，按上述条件离心，弃去滤液。

（注意：浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。

）
10、（可选）弃去滤液，重复第9步骤一次。

（其中的一管重复步骤9）
11、弃去滤液，把柱子重新装回收集管，13000r/min离心空柱2min以甩干柱子基质。

（注意：不要忽略此步——这对去除柱子中残留的乙醇至关重要。

）
12、把柱子装在干净的 1.5mL离心管上，加入50μL Elution Buffer到柱子基质中，静置1-2min，13000r/min离心1min，洗脱出DNA。

13、电泳检测：在离心管中加入2μLddH2O、2μL质粒以及1μLloadingbuffer，轻弹/吹吸混匀，快速离心集液于管底，上样，跑电泳。

表5重组质粒的电泳检测——上样顺序
泳道
1 2 3 4 5 … 15 16 17
18
样品 超螺旋
marke r rpST 1-1
rpST 1-2
…
rpST 8-1
rpST8-2 pUC19
样量/μL
6 5.0 5.0 … 5.0 5.0 5.0
2、实验结果及分析
2.1质粒酶切电泳检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617
图1重组质粒电泳图
7泳道是我们组的结果。

对比酶切时的marker 和商业酶切质粒，我组电泳条带自上而下依次为：最上方条带在2.6-2.7kb 左右，而且每组都有，因此可判断此条带为线性pUC19质粒；第二条带基本上在双螺旋pUC19质粒的位置，因此此条带基本上为未切开的双螺旋pUC19质粒；最下面白色不成条带的部分明显为未降解的RNA 。

由此可以看出载体质粒pUC19酶切的不彻底。

2.2连接反应检测
图2连接反应涂板检测
左图为有氨苄青霉素的平板，DH5α为氨苄敏感型，不能在含氨苄青霉素的平板上生长；pUC19带有氨苄青霉素抗性基因，可在含氨苄青霉素的平板上生长。

故未导入pUC19的受体细胞在含有氨苄青霉素的培养基上不生长，只要在含氨苄青霉素的平板上生长的菌落均为导入pUC19的受体细胞。

右图为不含氨苄青霉素的平板，DH5α生长旺盛，形成菌苔，平板变黄；导入pUC19的受体细胞也能正常生长。

2.3重组子筛选结果
表6麦康凯培养基菌落形态特征
平板
是否含氨苄青霉素 是否生长 大小
数量
菌落颜色 培养基
颜色 I-50-1 是 是 小 62 红 红 I-50-2 是 是 小 77 红 红
I-100-1 是 是 小 菌苔 白 黄 I-100-2 是 是 小 129 红 红 I-150-1 是 是 小 多 红 红 I-150-2 是 是 小 多 红 红 I-200-1 是 是 小 多 红
红 I-200-2 是 是 小 多 红多白8 红 II-50 是 是 大 多 红 红 III-50 是 否 红 III-50 否
是
小
多
白
黄
其中1-100-1的平板生长状况不符合预期，可能原因是误用了不含氨苄青霉素的平板。

其他生长符合预期的平板中，菌落数随菌液体积增加而增加。

质粒pUC19进入E.coliDH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。

在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH 降低，培养基中的中性红指示剂变红，转化子的菌落变红；重组后的载体DNA 因为目的基因的插入位点在pUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。

从红白菌落的计数结果来看，重组数量很低。

2.4重组质粒电泳图
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415161718
图3重组质粒电泳图
其中第2、3泳道是我们组的结果，与pUC19对比可以看出，条带大小差别不大，可能没有插入外源片段或者插入了大小为125bp的片段。

2、注意事项
3.1本实验属于微量操作技术，无论是DNA样品还是酶的用量都极少，
必须严格注意吸样量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。

3.2实验中所用塑料器材（Ep管，枪尖等）都必须是新的，并且经过高
温灭菌，操作时打开使用，操作过程不要求无菌，但要注意手和空气中杂酶的污染，因此要注意环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Ep管开盖的时间。

3.3不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加重蒸水，其次
是缓冲液和DNA，最后加酶。

且前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。

取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。

酶液使用完毕应立即放回冰箱，防止酶的失活。

3.4Ep管的盖子应盖紧，防止水浴加热的过程中水汽进入管内，并做好
标记以防样品混淆。

3.5由于受热，酶切反应结束时，装有酶切样品的管盖上会有大量的冷
凝水，应离心2s，使样品集中于管底，再开盖取样检测。

注意防止污染。

3.6感受态细胞必须从纯菌种开始。

要从划线纯化的单菌落开始，进行
活化培养，不要使用多次转接或储存在4℃的培养菌液，其目的是保持菌株的纯度和活力。

3.7控制细胞的生长状态和密度是转化效率的关键，细胞生长浓度以刚
进入对数生长期为好，可通过监测培养液的A600来控制。

细胞浓度不足或过高均会使转化效率下降，不过不同菌株感受态需要的最适A600不同。

3.8转化质粒的质量高，浓度合适。

用于转化的质粒DNA应是超螺旋状
态的DNA(cccDNA)。

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，当加入外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率反而会降低。

一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

3.9转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行。

所用器皿如离心管、吸头等均为一次性使用的，并经高温灭菌处理，所用试剂也需高温灭菌或过滤除菌，以防被微生物DNA污染。

【参考文献】
汪天虹分子生物学实验。