生化分析技术(三)

临床化学常用分析技术(三)

层析技术

（一）层析技术的原理

层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。

所有的层析系统都由两个相组成：

固定相：大多是固体物质或是固定于固体上的成分。

流动相：由水和各种溶媒组成（液体或气体）。

当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。

分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。（二）层析法分类

液体

按层析原理还可将层析分为：凝胶层析、离子交换层析、高效液相层析、亲和层析。1.凝胶层析

又称分子筛过滤或排阻层析等。

固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度（移动速度）也不同。

优点：所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，操作条件温和，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。

常用的凝胶有Sephadex G（葡聚糖凝胶）系列。

凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。

2.离子交换层析

采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。

主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物

分子。

3.高效液相层析

在经典液相层析法基础上，引进气相层析的理论而发展起来的一项新颖快速的分离技术。

具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点，对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤其有利。

根据流动相和固定相相对极性，高效液相色谱分析可分为正相和反相两种。

4.亲和层析

利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。

将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质才能被固定相吸附结合，无关组分随流动相流出。

改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。

亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。

具有专一亲和力的生物分子对主要有：

抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物，激素与受体，维生素与特异结合蛋白，糖蛋白与植物凝集素等。

亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。

电化学分析技术

1.基本原理

利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法称为电化学分析法。

2.离子选择性电极分析法

用离子选择电极直接电位法测定离子浓度，常用在多种体液（血、尿、唾液、脑脊液等）中Ca2+、K+、Na+、Cl-、F-和碳酸氢盐等离子测定。

使用离子选择性电极电位分析法测定的是离子活度a，而一般分析中要求测定的是离子浓度c，二者关系为：

A=f·c，其中f为活度系数。