糖尿病小鼠模型的制备

一、糖尿病的概念及分类

糖尿病已成为全人类继恶性肿瘤和心脑血管病之后的严重威胁人类健康的第三大非传染性疾病。目前我国己成为世界第一糖尿病大国。

糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的、具有明显异质性的慢性高血糖症及其并发症所组成的综合征，并非单一病因所引起的单一疾病(多原因引起的综合症）。糖尿病分为：Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病和其它特异性糖尿病。Ⅰ型糖尿病即胰岛β细胞大量破坏，常导致胰岛素绝对性缺乏，以往称为胰岛素依赖型糖尿病、青年发病型糖尿病，“三多一少”症状明显。本型病因及发病是由于胰岛β细胞受到细胞介导性自身免疫性破坏。Ⅱ型糖尿病由于胰岛素抵抗并胰岛素分泌不足所致，以高血糖高血脂为显著特点。以往称为非胰岛素依赖型糖尿病、成年发病型糖尿病，常伴有明显的遗传因素，但遗传机制尚未阐明。其它特异性糖尿病包括，β细胞功能的基因缺陷、胰岛素作用的基因缺陷、胰腺外分泌疾病、内分泌疾病、药物或化敏学制剂所致的糖尿病、感染、非常见型免疫介导性糖尿病以及有时并发糖尿病的其它遗传综合症。

（糖尿病是无法根治的，现在随着人们生活水平的提高，饮食习惯，生活方式的改变糖尿病的发病率节节攀升，成为威胁人类健康的一大难题。人们曾经一度把糖尿病称为富贵病这也是有一定道理的。为了提高人们的生活质量，近几年对糖尿病的研究日益加深）

二、糖尿病模型的建立

近年来，随着国内外对糖尿病治疗药物研究的深入开展，建立比较理想的糖尿病动物模型显得尤为重要。目前常用的动物模型有实验性动物模型和自发性动物模型。自发性模型应用价值较高，但因价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格，而不能得到广泛应用。实验性模型则应用比较广泛，实验性糖尿病动物模型的建立，是用各种方法损伤动物胰脏或胰岛β细胞导致胰岛素的缺乏，或用化学药物对抗胰岛素作用，导致动物出现高血糖形成糖尿病。实验性糖尿病动物模型的建立主要有6种方法：胰腺切除法致糖尿病、免疫性糖尿病、激素性糖尿病、下丘脑损伤性糖尿病、化学性糖尿病、病毒性糖尿病。由于化学性糖尿病动物模型诱发简便、来源广，应用较广泛。目前多采用注射化学诱导剂(链脲佐菌素或四氧嘧啶)的方法，引起短时间内胰岛β细胞大量损害而诱发糖尿病动物模型的建立。

1、糖尿病模型小鼠

多采用6-8周龄雄性小鼠，品系国内以昆明小鼠和ICR小鼠居多，由于价格便宜且药物敏感性高，应用较广泛。此外还有NODSCID小鼠、CD-1小鼠、C57BL／6小鼠、BALB／c小鼠、NMRI小鼠。

2、化学诱导剂及致病机制

目前常用的药物有链脲佐菌素STZ和四氧嘧啶ALX ，其作用机制都是选择性损伤胰腺β细胞，引起β细胞坏死，导致血胰岛素不同程度下降伴血糖升高，形成胰岛素依赖型糖尿病。与四氧嘧啶糖尿病不同，链脲佐菌素引起的糖尿病高血糖反应及酮症均较缓和，所致糖尿病模型也更加稳定。

（1）链脲佐菌素STZ

STZ是由致癌物质MNU衍生的一种2-脱氧-右旋-葡萄糖，STZ致糖尿病的机制是通过其本身含有的葡萄糖部分结构被胰岛β细胞上低亲和力的葡萄糖转运蛋白(GLUT2)转运，特异性地作用于胰岛β细胞，引起特殊位点烷基化，进一步导致多聚ADP核糖体激活，胞内NAD+和ATP耗竭，最终导致大量反应性氧簇产生，引起其结构破坏和胰岛素分泌功能障碍。此外还可以通过产生活性氧和NO发挥间接损伤作用。

STZ是从无色链霉素分离出来的一种广谱抗生素，为无色固体，易溶于水，水溶液在室温下极不稳定，可在数分钟内分解成气体，因此溶液要在pH4低温避光的环境中保存，且现配现用。样品在称取的过程中要严格保证周围环境的干燥，如确实需要多次称取，要严格按照避免受潮的原则操作和存放。操作方法：操作环境、盛装容器、分装工具都必须保证干燥。无需冰浴，分装后用封口膜密封瓶口，用铝箔纸(或锡箔，即避光)将瓶子包好，放入干燥罐里（干燥剂，即保持干燥状态），并2-8℃冷藏，可长期保存。STZ的溶剂一般选用pH 4.2-4.8柠檬酸缓冲液(0.1mol／L)。溶剂配制完成后，用0.2um 的微孔滤膜过滤灭菌消毒备用。STZ配制过程都要在低温环境中进行，以保证STZ的药效性，提高造模的成功率。

小鼠注射链脲佐菌素后，血糖水平的改变可分为三个时相：①早期高血糖相，持续约1~2小时，是STZ抑制胰岛释放所致。据此，一般小鼠注射STZ两小时后，给予正常进食；②低

血糖相，持续约6~10小时，可能是由于胰岛β细胞破坏，大量胰岛素释放，致使血糖显著降低。为防止小鼠出现持续低血糖而惊厥死亡，在给予饲料的同时喂以5%的葡萄糖水24h；③24小时后出现稳定的高血糖相即糖尿病阶段，此时大部分胰岛β细胞已呈现不同程度的损伤和破坏。

（2）四氧嘧啶（alloxan）ALX

四氧嘧啶对胰岛β细胞有特异性的毒性作用，可选择性地损伤多种动物的胰岛细胞而引起实验性糖尿病，它通过产生超氧自由基破坏β细胞，使细胞内DNA损伤，并激活多ADP 核糖体合成酶的活性，从而使辅酶I 含量下降，导致mRNA功能受损，β细胞合成前胰岛素减少，最终导致胰岛素缺乏。这种作用机制与临床I型糖尿病患者的发病机制相近。

四氧嘧啶引起的血糖反应也分三个时相,开始血糖升高,持续约2ｈ,继而因β细胞残存的胰岛素释放引起低血糖约6ｈ,12ｈ后开始持久的高血糖。

四氧嘧啶其水溶性不稳定，应现用现配。注射速度要快，这样成模率较高。配制所需的溶剂一般为生理盐水。

此外，还有肾上腺素诱导的糖尿病。肾上腺素是强有力的升高血糖的激素，它的作用机制是与肝和肌细胞膜的β受体结合，通过G蛋白激活腺苷酸环化酶、增高细胞内cAMP浓度，蛋白激酶级联激活磷酸化酶、抑制糖原合酶，从而加速糖原分解、抑制糖原合成。属于胰外性糖尿病。

3、造模的方式方法

小鼠造模前一般禁食12-18小时。对普通饲料喂养的小鼠注射STZ前的禁食处理是非常关键的。禁食的时间越长，链脲佐菌素对胰岛β细胞的破坏力越明显，即药效越高。所以相对禁食时间延长，可以降低链脲佐菌素的用量。。禁食处理之所以与注射STZ后血糖变化密切相关，推测与禁食处理可以降低血液胰岛素和leptin水平，并显著下调脂肪组织ob基因表达有关(Tray-hurn et a1．，1995；Mizuno et a1．，1996)，为STZ进一步损害胰岛β细胞提供了有利的内部环境。