酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究

仪器与试剂
仪器：分光光度计 植物组织捣碎机 离心 机 恒温水浴 试剂：pH6.8磷酸盐缓冲溶液 多巴溶液 （200mg/L） 铜试剂（10-3mol/L） 土豆

实验步骤


1.络氨酸酶的提取：取75g的去皮土豆，切碎，置于植物组 织捣碎机中，加入冷却的磷酸盐缓冲溶液150ml，在高速转 速下捣碎2分钟，然后倒入干净烧杯中静置2分钟，去上层清 液于离心式管中在3000r/min转速下离心分离5分钟。 2.Km和vmax的测定：在6支比色管中按表1加入缓冲溶液、多 巴溶液，摇匀、30℃恒温10min，再在00、0、1号比色管各 加入络氨酸酶提取液各0.20mL，摇匀后立即倒入比色皿中， 以00号为参比溶液，测量其吸光度，前5min每隔30s测量一 次溶液的吸光度，后5min每隔60s测量一次溶液的吸光度， 并记录溶液的吸光度和对应反应时间。以同样方法测量2-5 号溶液的吸光度并记录数据。
影响酶促反应速度的因素： 酶的浓度[E] 底物的浓度[S] 溶液的pH值 温度 酶的抑制剂 酶的激活剂

二、实验原理
酶催化剂的特点


1.具有表观活性和专一性所需要的结构空间，反应能在比较 温和的条件下进行； 2.酶促反应的活化能较低； 3.酶的催化效能极高； 4.酶具有高度的专一性。
影响酶作用的因素：酶的浓度、底物浓度、 溶液的pH值、和酶抑制剂等。
米氏方程 [S]、[E]分别为底物浓度和酶的浓度，km为米 氏常数，其物理意义是当酶促反应速度到达 最大速度一半时的底物浓度，单位mol/L


对米氏方程进行双倒数得到：坐标作图，由图得 到截距和斜率，即可计算vmax和Km。

实验注意事项
1.络氨酸酶的提去要现提现用； 2.提取时的温度不能太高； 3.反应温度的设置应低于40℃； 4.反应温度应保持恒定。

1 2
3
4
5
时间 1吸光度 浓度
2 3 4 5
1.根据朗伯-比尔定律，将测得的吸光度计算 转化为浓度，以浓度为纵坐标，时间为横坐 标作图，求得直线的斜率即为反应的速度v； 2.根据双倒数米氏方程，以1/v为纵坐标， 1/[S]为横坐标作图，求得直线的截距和斜率 即可计算反应的最大速度vmax和米氏常数Km； 3.抑制剂的影响：求出未加入和加入抑制剂 的反应速度，以反应速度为纵坐标，抑制剂 浓度为横坐标作图，判断抑制剂对反应的影 响。
一、底物浓度对酶促反应的影响
随反应物浓度S的增大，酶促反应速度V 增大。当底物的浓度较低时，V随〔S〕 增大而急剧增大，二者成正比关系；随 着〔S〕的继续增大，V继续增大，而增 幅逐渐减小，若再继续增大〔S〕，则V 将不再变化， 达到一个极 限值Vmax。

酪氨酸酶对多巴的催化氧化原理

酪氨酸酶的提取及 其酶促反应动力学 研究
一、实验目的
1.认识生物体中酶的存在，了解生物体系中酶 促反应的特点； 2.了解底物浓度对酶促反应速度的影响； 3.了解抑制剂对酶促反应速度的影响； 4.掌握用双倒数作图法求米氏常数； 5.实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并就 其酶促反应的动力学研究其活性。
5 1.8 3.0 0.2
4.8 0.0 0.2
数据记录表2
项目
缓冲溶液 多巴溶液
0 4.6 0
1 2.6 2.0
2 2.5 2.0
3 2.4 2.0
4 2.3 2.0
5 2.2 2.0
铜试剂
酶提取物
0
0.4
0
0.4
0.1
0.4
0.2
0.4
0.3
0.4
0.4
0.4
数据记录及处理
时间 0吸光度 浓度

3.抑制剂的影响：按表2的所列的数据进行溶 液的配制，以0号溶液为参比溶液，按步骤2 的方法测量各个溶液的吸光度随时间的变化。
数据记录表1
项目 00
缓冲溶 液 多巴溶 液 酶提取 物
0 3.8 1.0 0.2
1 3.8 1.0 0.2
2 3.3 1.5 0.2
3 2.8 2.0 0.2
4 2.3 2.5 0.2