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酶动力学综合实验

实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定

【目的要求】

1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响

2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。

【实验原理】

1、碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。

2、米氏方程：

Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：

(1)

式中：v表示酶促反应速度，

表示酶促反应最大速度，

[S]表示底物浓度，

表示米氏常数。

3、值的测定主要采用图解法，有以下四种：

①双曲线作图法（图1-1，a）

根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。

②Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）

实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式：

(2)

以对作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—。

③Hofstee作图法（略）

把（2）式等号两边乘以，得：

(3)

以v对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为。

④Hanas作图法（略）

把（2）式等号两边乘以[S],得：

(4)

以对[s]作图，这时斜率为，纵截距为。

（a）(b)

本实验主要以双倒数法，即Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：

本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和60℃），准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：

然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。

【仪器与试剂】

仪器：

1.恒温水浴

2.721型分光光度计

试剂：

1．酚试剂：称钨酸钠（W·2O）100g，钼酸钠（Mo·2O）25g

置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。

充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。

2．2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2•2H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。

3．碱性缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.

4．碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。【实验步骤】

取6支试管按下表加入试剂：

1 2 3 4 5 6

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 2.5mM磷酸苯二

钠（ml）

蒸馏水（ml）0.8 0.6 0.4 0.2 - 0.1 碱性缓冲液

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

（ml）

混匀后，60℃欲温5分钟

碱性磷酸酶液

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 -

（ml）

混匀后，60℃水浴13分钟（准确计时）

注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加

2）此时为酶促反应，总体积2.1ml

3）第六管不加酶。

酚试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 10%Na2CO3(ml

)

混匀后，室温放置15分钟

注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试

剂后酶促反应即停止。

2）Na2CO3 提供碱性环境，加入Na2CO3 后试剂才显色

以6管为调零点，在620nm波长处比色。

【结果处理】

1 将各管光密度和底物浓度记入下表

管号O.D 1/O.D [S] 1/[S]

1

2

3

4

5

2以1/O.D为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lineweaver- Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km值。

【注意事项】

1）加入碱性磷酸酶的量要准确

2）保温时间要准确

准确保温的方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔1分钟向下一只试管加酶液,直至加完，到准确13分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔1分钟向下一只试管加酚试剂,直至加完止，这样保证每管准确保温13分钟。【思考题】

1）Km 的意义及其影响因子

2）为什么酶促反应速度以初速度表示

3）为什么O.D可直接代替V作图

4）分析自己的实验数据

实验（二）——温度对酶活性的影响

【实验目的】

了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。

【实验原理】