芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析_万红贵

芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析
万红贵,袁建锋,单咸旸,朱明新,宗素艳,石楠
(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京,210009)
摘 要 从筛选自新疆罗布泊沙漠的1株芽孢杆菌的发酵滤液中分离得到胞外多糖EPS 和EP S ,其中EPS 为主要成分,占总糖的89 5%,EP S 为糖蛋白,其分子质量为96 292ku,多糖含量为93 79%,蛋白含量为5 62%,不含糖醛酸,是由D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖构成,它们的摩尔比例是2 36 0 98 1 75。

EPS 为 型吡喃糖,经高碘酸氧化和Smit h 降解,EPS 中含有(1 ),(1 3)和(1 4)糖苷键,且(1 )和(1 4)糖苷键的比例为1 24 05,其中的糖肽是O 糖苷键。

关键词 芽孢杆菌,糖蛋白,结构分析
第一作者:硕士,研究员。

收稿日期:2008-10-24,改回日期:2008-11-19
细菌多糖主要以3种形式存在:胞内多糖、胞壁
多糖和胞外多糖。

广义上的胞外多糖指的是糖被(gly cocalyx ),包括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团,对细菌本身来说它具有很多的功能。

例如:保护细菌免受干旱损伤、免受宿主细胞的吞噬、储藏养料、堆积某些代谢和表面吸附作用等等;狭义上的胞外多糖指的是黏液层,是一种扩散到培养基中的多糖,也是人们通常所说的胞外多糖
[1]。

细菌胞外多糖除了其对细菌自身的生物学意义之外,更重要的是由于它具有安全无毒、理化性质独特、用途广泛、易与菌体分离及可通过深层发酵实现工业化生产等优良性质而备受关注
[2]。

近些年来,一
些具有生物活性的细菌胞外多糖开始引起人们的重视,它们同一些真菌多糖和中草药多糖一样,对机体具有很强的免疫增强和抗肿瘤作用。

因此,它们作为一种新型糖,成为科学工作者研究的一个新热点。

本课题报道了细菌发酵粘液中分离得到多糖EPS 的理化性质和一级结构,为以后的进一步生物学功效的研究打下基础。

1 材料与方法
1 1 供试菌株
芽孢杆菌(Bacillus),筛选自新疆罗布泊沙漠。

1 2 仪器和试剂
TGL 16G 高速离心机,上海安亭科学仪器厂;RE 52AA 旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;All tech 高效液相色谱仪,426型H PLC 泵,ELSD 2000
检测器,Alltech 色谱工作站,美国奥泰科技有限公
司;SH B 循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;数显恒温水浴锅H H 4,国华电器有限公司;PH S 3C 精密pH 计,上海精密科学仪器有限公司;DZF 602型真空干燥箱,上海博讯实业有限公司;BS 100A 自动部分收集器,上海沪西分析仪器厂;N ico let380FT IR,美国热电公司T herm o;TU 1901双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;柱层析系统;BS124S 电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司。

活性炭;Sephadex G-100(Wolsen);标准葡聚糖(Dex tran)(A R,国药集团化学试剂有限公司);其余试剂除注明外都为分析纯试剂。

1 3 培养基和培养条件
培养基使用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基。

16h 的种子以1%(体积比)的接种量转接至发酵培养基,500mL 发酵摇瓶的装液量为50mL,于30 ,200r/m in 的条件培养48h 。

1 4 胞外多糖EPS 的制备
发酵液经离心除去菌体,得到的上清液使用Sevag 法除去杂蛋白,调节pH 值为7 0,以1 4的体积比加95%的乙醇,4 放置24h,10000r/m in,10m in 离心收集沉淀,真空干燥得粗多糖。

将粗多糖溶解后上活性炭柱(1 5cm 24cm ),先用蒸馏水60mL 洗脱,再用60%乙醇60mL 洗脱,最后使用95%乙醇60m L 洗脱,每150s 收集1管洗脱液,硫酸 苯酚法跟踪多糖分布,同时用考马斯亮蓝法跟踪蛋白质分布,收集主峰部分。

经过真空浓缩,上SephadexG 100柱纯化,硫酸苯酚法监测,收集其主峰部分,使用95%乙醇沉淀,真空干燥得到多
糖纯品。

1 5 多糖的理化性质及组成分析
1 5 1 EPS 的分子质量测定
采用凝胶过滤色谱法测定[3]。

1 5
2 多糖的组成分析
1 5
2 1 多糖含量测定
采用硫酸 苯酚法[4],以葡萄糖作标准曲线,490 nm检测波长。

同样的操作,取1m L的样品液,测定490nm吸收值,由标准曲线计算多糖含量。

1 5
2 2 蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝法[5],以牛血清蛋白作标准曲线,检测波长595nm。

1 5
2
3 多糖中糖链 肽链的连接方式的确定( 消除反应)[4]
称4mg样品,溶解于3mL蒸馏水中,加入3 mL的0 4mol/L NaOH,于25 下反应,在开始和反应后的1 5h,分别进行紫外测定,根据碱处理后的多糖在240nm处光吸收值的变化,即是否出现羟基不饱和氨基酸的特征吸收,来判断多糖中糖与蛋白质结合的连结方式。

1 5
2 4 单糖组成分析
称取3mg样品,按1 5 2 3操作,除去蛋白质肽链,调节pH值为7 0,经过透析袋透析12h,流水透析24h,然后加入5mL的2mol/L三氟乙酸,塞紧试管塞子,于80 下水解2h,结束后加入3mL的甲醇,60 下真空浓缩除去三氟乙酸,所得样品进行H PLC分析,用标准单糖进行外标,确定单糖组成。

色谱分析条件:Prevail Carbohydrate ES(250 mm 4 6mm,5 m)糖柱;流动相:V(乙腈) V(纯水)=75 25;流速:1 0m L/min;检测器ELSD 2000漂移管温度:80 ;气体流量:2 0L/m in;进样量:80 L。

1 5
2 5 糖醛酸含量分析
采用硫酸咔唑法[6]。

1 6 多糖一级结构的初步分析
1 6 1 光谱全波长扫描
配制1mg/mL多糖溶液,以蒸馏水作为对照,于200~600nm波长区域扫描。

1 6
2 红外光谱测定
采用KBr压片法[4]。

1 6 3 高碘酸氧化[4]
称取多糖样品25mg,用少量水溶解,加入30 mmo l/L NaIO4溶液,定容至25m L,置于暗处,室温下进行反应,于0,6,12,24,36,48 h间隔取样0 1 m L,蒸馏水稀释250倍后,使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。

至光密度值达到稳定值时,加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。

由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量,即可推算出每个糖基的高碘酸量。

取2mL上述反应溶液,使用0 01m ol/L的NaOH标准溶液测定甲酸的生成量,剩余部分进行Sm ith降解。

1 6 4 Smith降解[4]
将1 6 3操作所剩下的溶液加入乙二醇并搅拌30m in以还原剩余的高碘酸。

对流水透析48h,蒸馏水透析过夜,于40 以下减压浓缩至10mL左右,加入70mg硼氢化钾于室温,暗处搅拌18~24h以还原多糖醛。

用0 1mol/L醋酸中和至pH6~7,对流水透析48h,蒸馏水透析24h,减压蒸干,加1 m ol/L H2SO42mL,封管,100 水解8h,用BaCO3粉末中和,定量滤纸过滤,滤液减压浓缩。

薄层色谱法检测降解产物,展开剂为V(正丁醇) V(乙酸) V(水)=4 l 5;显色剂为A gNO3。

点样采用甘露糖、赤藓醇、甘油标准品作为对照。

2 结果
2 1 理化性质分析
纯化后的多糖样品EPS 为棕灰色粉末,易溶于水,不溶于高浓度的乙醇、甲醇、以及丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂。

其水溶液呈棕灰色黏稠状,与咔唑 乙醇液反应呈粉红色,苯酚 硫酸液反应呈黄棕色,蒽酮 硫酸液反应呈蓝绿色,与碘溶液不反应。

2 2 分子质量的测定
用蓝色葡聚糖-2000上Sephadex G-100柱,测得外水体积V o,用标准分子质量的葡聚糖上柱测得各自的洗脱体积V e。

用V e/V o值对标准分子质量对数(Lo g M W)绘制标准曲线,得到回归曲线方程y =-1 8322x+2 2259(R2=0 9987),由EPS 上柱的洗脱液体积V e计算得分子质量为96 292ku。

2 3 多糖组分分析
2 3 1 多糖含量和蛋白质含量分析
以葡萄糖为标样,采用苯酚 硫酸法在490nm处测定不同标糖光密度值,以葡萄糖质量(g)为横坐标,光密度值为纵坐标制作标准曲线。

测得样品光密度值,根据回归曲线方程y=0 07247x+0 00563(R2 =0 9983),计算得出纯化后的EPS 糖含量为
93 79%。

以牛血清白蛋白为标准品,考马斯亮蓝法在595 nm波长处测定蛋白质含量,得到标准曲线,根据回归曲线方程y=0 5695x-0 0095(R2=0 9986)得到EPS 中蛋白质含量为5 62%。

2 3 2 糖链 肽链连接方式的确定
EPS 经0 4mo l/L NaOH于25 水解1 5h 后,对比240nm处的紫外吸收值,其结果如表1所示,在240nm处有明显的增大趋势,即出现了羟基不饱和氨基酸的特征吸收,因而可确定EPS 中糖肽的结合方式为O 糖苷键。

表1 碱处理前后EPS 在240nm处的紫外吸收
处理方式时间/h240nm吸光度
碱处理前
01 265 1 51 694
碱处理后
01 264 1 51 265
2 3 3 单糖组分分析
EPS 经1 5 2 4操作与D 葡萄糖、D 木糖、D 甘露糖、D 鼠李糖、D 半乳糖、D 葡萄糖醛酸、D N 乙酰葡萄糖胺进行H PLC分析,结果如图1。

D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖,响应时间分别为2 254,7 025和8 726。

与EPS 的图谱进行比对,确定EPS 的单糖组成为D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖,它们的摩尔比是2 36 0 98 1 75。

图1 标准单糖溶液和EPS 的色谱图
2 3 4 糖醛酸含量测定
以标准葡萄糖醛酸作为对照,通过硫酸咔唑法,制作糖醛酸含量标准曲线,由回归曲线方程y= 3 4634x-0 0101(R2=0 9994),得EPS 中不含糖醛酸。

2 4 多糖一级结构的初步分析
2 4 1 光谱全波长扫描分析
EPS 的光谱扫描(图2)表明,在260nm未发现核酸特征吸收,但在280nm发现有极微弱的蛋白吸收,这与蛋白含量测定中,蛋白质含量较低相对应。

图2 EP S 的紫外吸收图谱
2 4 2 红外光谱分析
EPS 的红外光谱(图3)表明,在3500cm-1~ 2800cm-1和1665cm-1~1635cm-1的吸收峰表明EPS 为糖类化合物,其中3420cm-1为羟基O H 的伸缩振动,2925cm-1为糖类的C H伸缩振动,1 650cm-1为糖的乙酰氨基的特征峰;1250cm-1~ 950cm-1的一组吸收峰,是吡喃糖环的醚键(C-O-C)和羟基吸收峰,890cm-1附近是吡喃糖 型C-H 变角振动的特征峰,由此可以推断EPS 中有 型糖苷键。

图3 EP S 的红外吸收图谱
2 4
3 高碘酸氧化和Sm ith降解
在高碘酸氧化反应过程中,每间隔12h取样检测反应液的光密度,由图4可见,在100h后光密度趋于稳定,终止反应,根据高碘酸标准曲线y=0 046 6x-0 0590(R2=0 9998),此时高碘酸的消耗量为1 202mm ol,同时,生成的甲酸量为0 025mm ol,即EPS 中含有(1 )末端糖苷键,高碘酸氧化后的反应液经硼氢化钾还原为多糖醇,经硫酸水解后薄层层析鉴定水解产物。

由图5可见,EPS 经Smith降解后产生甘露糖和赤藓醇,说明EPS 中包含(1 3)和(1 4)糖苷键,而(1 3)糖苷键链接的糖在高碘酸氧化中不消耗高碘酸,Sm ith降解后仍为原来的糖,即有部分甘露糖以(1 3)糖苷键链接,且(1 )末端糖苷键与(1 4)的比例为1 24 05。

图4 高碘酸氧化进程
图5 Sm ith降解产物薄层层析
3 结果与讨论
(1)纯化后的糖蛋白EPS 经水解后进行H PLC 分析单糖组成,由D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖构成,它们的摩尔比例是2 36 0 98 1 75,通过红外光谱分析、高碘酸氧化和Smith降解分析推测EPS 为 型糖苷键连接的吡喃糖,其中含有(1 3)糖苷键,(1 4)糖苷键及末端(1 ),糖肽的链接方式为O 糖苷键,但因试验条件所限,甲基化反应和核磁共振分析工作无法进行,因而具体的连接方式和构型无法准确得出。

(2)与蛋白质、核酸相比,多糖的结构相当复杂,测定和分析工作量很大,而且需要多种大型精密仪器,成本高,因而本研究仅对EPS 的一级结构作了初步分析,为以后进一步的研究打下基础,如要精确测定其二级、三级甚至四级结构,还需大量的工作,进行更系统的研究。

参考文献
1 李江,陈靠山,郝林华,等 细菌胞外多糖的研究进展
[J].海洋科学,2006,30(4):74~77
2 Elena L,Isr ael R,A nzeles S M Ex tr acellular po lysaccha
rides product ion by A r thr obacter viscosus[J].Jo urnal of Fo od Eng ineer ing,2003,60:463~467
3 郭勇 现代生化技术[M].广州:华南理工大学出版社,
1995 1~222
4 张惟杰 糖复合物生化研究技术(第二版)[M].杭州:浙
江大学出版,1999 1~540
5 Bradford M M A r apid and sensitiv e method fo r the quan
titatio n of micro gr am quantities o f pro tein utilizing t he principle of pro tein dy e binding[J].A naly tical Biochem is try,1976,72:248~254
6 Dische Z A new specif ic colo r reaction o f hexuro nic acids
[J].Jo urnal o f Bio lo gical Chemistr y,1947,167:189~ 198
Study on Structure of Exopolyseccharide of the Bacillus
Wan H onggui,Y uan Jianfeng,Shan Xianyang,
Zhu M ingx ing,Zong Suyan,Shi N an
(College o f Life Science and Phar macy,N anjing U niver sity o f T echnolog y,N anjing210009,China)
ABSTRAC T T he ex opolysaccharides EPS and EPS from fermentation filtrate o f Bacillus obtained fr om LU OBU PO Deser t w ere studied.A s the m ain com po nent,EPS w as acco unted fo r89.5%o f total sugar. This paper mainly reported the phy sical and chem ical pr operties and pr im ary str ucture of EPS .The results show ed that EPS w as protein-bo und polysaccharide.T he averag e m olecular weight of EPS w as96.292 KDa and po lysaccharide co ntent w as93.79%, 5.62%fo r protein,but had no ur onic acid.It w as co mpo sed of D N acetylg lucosamine,D x y lose and D m annose in the m olar r atio of2.36 0.98 1.75.T he mo nosac char ides of EPS w ere py ranose.Analy sis by periodate o xidation and Sm ith deg radatio n indicated that EPS w as composed of(1 ),(1 3)and(1 4)gly cosidic linkag es and the ratio of(1 )and(1 4)w as1 24.05.EPS w as ex pressed O linked glycoprotein.
Key words Bacillus,glycoprotein,structural analy sis。