芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析_万红贵

芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析

万红贵,袁建锋,单咸旸,朱明新,宗素艳,石楠

(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京,210009)

摘 要 从筛选自新疆罗布泊沙漠的1株芽孢杆菌的发酵滤液中分离得到胞外多糖EPS 和EP S ,其中EPS 为主要成分,占总糖的89 5%,EP S 为糖蛋白,其分子质量为96 292ku,多糖含量为93 79%,蛋白含量为5 62%,不含糖醛酸,是由D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖构成,它们的摩尔比例是2 36 0 98 1 75。EPS 为 型吡喃糖,经高碘酸氧化和Smit h 降解,EPS 中含有(1 ),(1 3)和(1 4)糖苷键,且(1 )和(1 4)糖苷键的比例为1 24 05,其中的糖肽是O 糖苷键。关键词 芽孢杆菌,糖蛋白,结构分析

第一作者:硕士,研究员。

收稿日期:2008-10-24,改回日期:2008-11-19

细菌多糖主要以3种形式存在:胞内多糖、胞壁

多糖和胞外多糖。广义上的胞外多糖指的是糖被(gly cocalyx ),包括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团,对细菌本身来说它具有很多的功能。例如:保护细菌免受干旱损伤、免受宿主细胞的吞噬、储藏养料、堆积某些代谢和表面吸附作用等等;狭义上的胞外多糖指的是黏液层,是一种扩散到培养基中的多糖,也是人们通常所说的胞外多糖

[1]

。

细菌胞外多糖除了其对细菌自身的生物学意义之外,更重要的是由于它具有安全无毒、理化性质独特、用途广泛、易与菌体分离及可通过深层发酵实现工业化生产等优良性质而备受关注

[2]

。近些年来,一

些具有生物活性的细菌胞外多糖开始引起人们的重视,它们同一些真菌多糖和中草药多糖一样,对机体具有很强的免疫增强和抗肿瘤作用。因此,它们作为一种新型糖,成为科学工作者研究的一个新热点。本课题报道了细菌发酵粘液中分离得到多糖EPS 的理化性质和一级结构,为以后的进一步生物学功效的研究打下基础。

1 材料与方法

1 1 供试菌株

芽孢杆菌(Bacillus),筛选自新疆罗布泊沙漠。1 2 仪器和试剂

TGL 16G 高速离心机,上海安亭科学仪器厂;RE 52AA 旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;All tech 高效液相色谱仪,426型H PLC 泵,ELSD 2000

检测器,Alltech 色谱工作站,美国奥泰科技有限公

司;SH B 循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;数显恒温水浴锅H H 4,国华电器有限公司;PH S 3C 精密pH 计,上海精密科学仪器有限公司;DZF 602型真空干燥箱,上海博讯实业有限公司;BS 100A 自动部分收集器,上海沪西分析仪器厂;N ico let380FT IR,美国热电公司T herm o;TU 1901双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;柱层析系统;BS124S 电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司。

活性炭;Sephadex G-100(Wolsen);标准葡聚糖(Dex tran)(A R,国药集团化学试剂有限公司);其余试剂除注明外都为分析纯试剂。1 3 培养基和培养条件

培养基使用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基。16h 的种子以1%(体积比)的接种量转接至发酵培养基,500mL 发酵摇瓶的装液量为50mL,于30 ,200r/m in 的条件培养48h 。1 4 胞外多糖EPS 的制备

发酵液经离心除去菌体,得到的上清液使用Sevag 法除去杂蛋白,调节pH 值为7 0,以1 4的体积比加95%的乙醇,4 放置24h,10000r/m in,10m in 离心收集沉淀,真空干燥得粗多糖。

将粗多糖溶解后上活性炭柱(1 5cm 24cm ),先用蒸馏水60mL 洗脱,再用60%乙醇60mL 洗脱,最后使用95%乙醇60m L 洗脱,每150s 收集1管洗脱液,硫酸 苯酚法跟踪多糖分布,同时用考马斯亮蓝法跟踪蛋白质分布,收集主峰部分。经过真空浓缩,上SephadexG 100柱纯化,硫酸苯酚法监测,收集其主峰部分,使用95%乙醇沉淀,真空干燥得到多

糖纯品。

1 5 多糖的理化性质及组成分析

1 5 1 EPS 的分子质量测定

采用凝胶过滤色谱法测定[3]。

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2 多糖的组成分析

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2 1 多糖含量测定

采用硫酸 苯酚法[4],以葡萄糖作标准曲线,490 nm检测波长。同样的操作,取1m L的样品液,测定490nm吸收值,由标准曲线计算多糖含量。

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2 2 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法[5],以牛血清蛋白作标准曲线,检测波长595nm。

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2

3 多糖中糖链 肽链的连接方式的确定( 消除反应)[4]

称4mg样品,溶解于3mL蒸馏水中,加入3 mL的0 4mol/L NaOH,于25 下反应,在开始和反应后的1 5h,分别进行紫外测定,根据碱处理后的多糖在240nm处光吸收值的变化,即是否出现羟基不饱和氨基酸的特征吸收,来判断多糖中糖与蛋白质结合的连结方式。

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2 4 单糖组成分析

称取3mg样品,按1 5 2 3操作,除去蛋白质肽链,调节pH值为7 0,经过透析袋透析12h,流水透析24h,然后加入5mL的2mol/L三氟乙酸,塞紧试管塞子,于80 下水解2h,结束后加入3mL的甲醇,60 下真空浓缩除去三氟乙酸,所得样品进行H PLC分析,用标准单糖进行外标,确定单糖组成。

色谱分析条件:Prevail Carbohydrate ES(250 mm 4 6mm,5 m)糖柱;流动相:V(乙腈) V(纯水)=75 25;流速:1 0m L/min;检测器ELSD 2000漂移管温度:80 ;气体流量:2 0L/m in;进样量:80 L。

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2 5 糖醛酸含量分析

采用硫酸咔唑法[6]。

1 6 多糖一级结构的初步分析

1 6 1 光谱全波长扫描

配制1mg/mL多糖溶液,以蒸馏水作为对照,于200~600nm波长区域扫描。

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2 红外光谱测定

采用KBr压片法[4]。

1 6 3 高碘酸氧化[4]

称取多糖样品25mg,用少量水溶解,加入30 mmo l/L NaIO4溶液,定容至25m L,置于暗处,室温下进行反应,于0,6,12,24,36,48 h间隔取样0 1 m L,蒸馏水稀释250倍后,使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。至光密度值达到稳定值时,加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量,即可推算出每个糖基的高碘酸量。取2mL上述反应溶液,使用0 01m ol/L的NaOH标准溶液测定甲酸的生成量,剩余部分进行Sm ith降解。

1 6 4 Smith降解[4]

将1 6 3操作所剩下的溶液加入乙二醇并搅拌30m in以还原剩余的高碘酸。对流水透析48h,蒸馏水透析过夜,于40 以下减压浓缩至10mL左右,加入70mg硼氢化钾于室温,暗处搅拌18~24h以还原多糖醛。用0 1mol/L醋酸中和至pH6~7,对流水透析48h,蒸馏水透析24h,减压蒸干,加1 m ol/L H2SO42mL,封管,100 水解8h,用BaCO3粉末中和,定量滤纸过滤,滤液减压浓缩。

薄层色谱法检测降解产物,展开剂为V(正丁醇) V(乙酸) V(水)=4 l 5;显色剂为A gNO3。点样采用甘露糖、赤藓醇、甘油标准品作为对照。

2 结果

2 1 理化性质分析

纯化后的多糖样品EPS 为棕灰色粉末,易溶于水,不溶于高浓度的乙醇、甲醇、以及丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂。其水溶液呈棕灰色黏稠状,与咔唑 乙醇液反应呈粉红色,苯酚 硫酸液反应呈黄棕色,蒽酮 硫酸液反应呈蓝绿色,与碘溶液不反应。

2 2 分子质量的测定

用蓝色葡聚糖-2000上Sephadex G-100柱,测得外水体积V o,用标准分子质量的葡聚糖上柱测得各自的洗脱体积V e。用V e/V o值对标准分子质量对数(Lo g M W)绘制标准曲线,得到回归曲线方程y =-1 8322x+2 2259(R2=0 9987),由EPS 上柱的洗脱液体积V e计算得分子质量为96 292ku。

2 3 多糖组分分析

2 3 1 多糖含量和蛋白质含量分析

以葡萄糖为标样,采用苯酚 硫酸法在490nm处测定不同标糖光密度值,以葡萄糖质量(g)为横坐标,光密度值为纵坐标制作标准曲线。测得样品光密度值,根据回归曲线方程y=0 07247x+0 00563(R2 =0 9983),计算得出纯化后的EPS 糖含量为