DNA重组实验常见问题分析

Sirtuins as potential targets for metabolic syndrome

Leonard Guarente1

Metabolic syndrome threatens health gains made during the past century. Physiological processes degraded

by this syndrome are often oppositely affected by calorie restriction, which extends lifespan and prevents

disease in rodents. Recent research in the field of ageing has begun to identify important mediators of

calorie restriction, offering the hope of new drugs to improve healthspan. Moreover, if metabolic syndrome

and calorie restriction are opposite extremes of the same metabolic spectrum, calorie restriction mimetics

might provide another therapeutic approach to metabolic syndrome. Sirtuins and other important metabolic

pathways that affect calorie restriction may serve as entry points for drugs to treat metabolic syndrome.

长寿蛋白作为代谢综合症的潜在目标

在二十世纪，代谢综合症威胁着人类的健康。相反地，该综合症导致的生理过

程退化常常受到卡路里限制。卡路里限制会延长寿命，保护啮齿类不生病。在

有关老龄化的领域里，最近有研究开始鉴别卡路里限制的重要中介，这为研制

新的药物提高寿命提供了希望。并且，如果代谢综合症和卡路里限制是同样代

谢光谱的两个相反极端的话，卡路里限制模仿将为治疗代谢综合症提供了新的

途径。长寿蛋白和其他重要的影响卡路里限制的蛋白途径可能作为治疗代谢综

合症药物的入口点。

载体用NotI单酶切，目的片段也用NotI单酶切，并对载体进行去磷酸化，但一直也没连上？

参考见解：

1、用NEB的高效连接酶连看看，用400U或2000U的试试

2、16度过夜连接，或更长

3、单酶切用PCR来鉴定方向方便些

4、去磷酸化后，将去磷酸化酶失活很重要，否则可能根本连不上。

5、失活的方法很多了，可以加热（有的热敏感酶可以），可以直接过胶回收柱子，但比较放心的方法就

是跑胶回收。

PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶切8小时，同时，p UC18 同样酶切，连接片段和载体DNA酶切均用QIAGEN quick spin column回收片段，按NEB 连接酶说明过夜连接，连接产物电转化。但是，看转化结果，连接产物转化的平板大部分是蓝斑？什么原因？

参考见解:

1、柱子回收一般没有问题，但会不会存在操作问题，所以回收产物可以跑胶或用紫外分光系统检测一下有没有DNA。

2、PCR产物直接酶切，在设计引物的时候有没有在酶切位点两边加保护碱基？这里pcr产物酶切出问题的可能性很大。

3、酶有没有问题？可以用这两个酶切一些已知的质粒看看能不能得到所要的片断。

4、大部分是蓝斑说明可能是载体酶切不完全，也可能是没有在载体酶切后跑胶回收载体，这样不能完全除去酶切掉的小片断（Qiagen的柱子对小片断的回收比较好），后来连接反应中小片断可能又连上了。

5、大部分是蓝斑，那就是还有白色的。挑了白色的摇了提质粒看看啊，说不定就有阳性的。

6、建议在载体酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化，这样可以彻底防止载体的自身环化。

酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭活限制酶(用的是Hind3/EcoR1双酶切),多高温度适合啊?

参考见解：

1、一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。比较适用于载体和PCR产物的连接。效果很好。

2、酶切后要胶回收后再连接,另外酶切结束后,直接电泳回收不用加终止液,对连接没有影响.

3、有的公司的限制酶（如NEB）是不需要热灭活的，而有的公司的限制酶（如MBI）则需要热灭活，一帮是65摄氏度，10分钟。然后经凝胶回收后再作连接，目的片段与质粒的摩尔比在3～10：1的范围内连接效果都不错。

4、通常随酶附送的loading buffer是含有SDS起到灭活的作用，但在上样时会产生很多泡沫。

一个质粒的双酶切，两种酶buffer一样，同时切胶。跑胶时，一个小片段看不到，大概600bp，怎么办？根据Marker把需要的4900bp的片段进行胶回收，效果特别差。用乙醇沉淀法回收，然后跑胶，回收，效果也不好。现在要做连接，可双酶切后质粒的回收不好，用于连接的质粒双酶切后怎么处理？把乙醇沉淀回收的双酶切质粒直接用于连接，这样可以吗？

参考见解：

1、做双酶切的时候用的buffer都是根据公司提供的双酶切最适buffer，每个公司应该都提供双酶切使用的buffer列表。

2、酶切后电泳条带比较好，切胶回收的效果不好，可能是回收过程中操作出现问题，或者是回收试剂盒有问题。可以尝试更换试剂盒做回收试试，或者看看酶切电泳后目的条带有没有弥散，如果有，切胶回收得不到好的效果。

3、用于连接的的片段应是单一的，如果将双酶切的质粒直接用于连接，即使得到了转化子，鉴定也比较麻烦，自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。最好用回收产物做连接。