细胞工程基本技术
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第三章 细胞工程基本技术
• 实验室
• 无菌技术
• 显微技术
• 细胞冻存与复苏
• 细胞的分离、观察与分析
一、实验室 1. 基本组成：
• 准备室
• 无菌间 • 操作间 • 培养室 • 分析室
2.主要设备：
包括 水处理设备（纯水系统）、无菌设备（灭菌
锅、超净工作台等）、培养设备（培养箱）、分离
观察设备（离心机、显微镜）、保存设备（超低温
• 不同固定剂对细胞的不同成分、结构固定效果不
同。
• 选择合适的固定液是达到固定目的的基础。
常用固定剂： • 甲醇/醋酸：浓度为3:1，适用于观察染色体和 Giemsa染色。 • FAA固定液（40%福尔马林5ml+冰醋酸5ml+80%乙醇90ml）： 可用作固定植物的一般组织。 • 卡诺氏（乙醇60ml+氯仿30ml+冰醋酸10ml）：适用 于显示细胞化学成分。
动，使其在1～2min完全融解； ③将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻 轻吹匀； ④将细胞悬液经离心5min。弃上清液； ⑤给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀；
⑥将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。
五、细胞观察与分析
• 细胞计数：采用血细胞计数法，结果以每毫升细
胞数来表示。可采用结晶紫染色 • 细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比。常用 方法为台盼蓝染色法
• 常用光学显微镜、相差显微镜、倒置显微镜、荧
光显微镜等
四、细胞的冻存与复苏 • 细胞在传代过程中许多生物学性状容易发生改变， 如细胞的粘附性、染色体数目等； • 对有限增殖细胞系来说，传代次数是有限的； • 过多的传代增加污染机会； • 消耗大量人力物力。 细胞冻存与复苏
冻存： • 低温液氮冻存 ：－196℃
细胞染 Giemsa染色：将细胞核染成紫红色，细胞质染成粉
红色；
• 福尔根染色：细胞核粉红至紫红色，细胞质无色；
• 考马斯亮蓝染色：显示细胞骨架；
• 荧光染色
Giemsa染色
苏木精-伊红染色
福尔根染色
考马斯亮蓝染色
荧光显微镜下的大肠杆菌
• 总结
冰箱、液氮罐等）
二、无菌技术 • 在细胞培养过程中，操作环境、试验器皿、试剂
等要经过灭菌处理，确保无污染。 • 包括：培养用品的清洗、灭菌
• 培养用品的清洗：玻璃器皿、胶塞、塑料制品 • 灭菌： 细菌、真菌、支原体、病毒污染是细胞培养的最 大危险。
常用灭菌方法： • 物理灭菌
紫外线灭菌：空气、操作台等； 湿热灭菌：培养液、玻璃器皿、手术器械等； 过滤除菌：含血清的培养液。
间或培养基中，有的呈链状排列。抗真菌剂可预
防（两性霉素B）。
丝状菌污染
• 支原体污染：直径在0.2µm以下，难以通过过滤除 去。（可采用地衣红染色或荧光染色进行判断）
支原体污染
• 病毒：大小以纳米计，可以通过滤器。潜在病毒
是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作 中的难题。 • 交叉污染
三、显微技术
• 在细胞冻存过程中需要添加冷冻保护液。
• 常用低温保护剂：
甘油（10%）或 二甲基亚砜（7.5%—10%）
• 原则：慢冻
复苏： • 按照一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到 常温。 • 原则：快融（1-2分钟内即恢复到常温）
冻存过程： ①分装冻存小管； ②冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～8℃)，40min； ③置于普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min； ④ -30℃放置30min左右； ⑤在-70～-80℃下过夜； ⑥最后将冻存小管投入液氮保存。
注意： 1，压线的细胞记上不记下、 记左不记右 2，抱团的细胞记成一个 3，抱团的细胞超过10%需 重新打散后再记
细胞密度（个/ml）＝（4个大格细胞总数/4）×104（10的4次方） ×稀释倍数
细胞固定：把组织和细胞的原有结构尽可能完整地
保存下来。
• 使细胞的各部分易于着色，适于观察和长期保存。
• 化学灭菌：最常用70%乙醇；皮肤、台面等 • 抗生素灭菌：抑制细菌、真菌等污染。
污染检测与控制：
• 细菌：培养液颜色发黄，变混浊，显微镜下可见
大量圆球状颗粒漂浮。
• 真菌：常见有黑曲霉、酵母菌、烟曲霉等
培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在 生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可 见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之
注意事项： • 常温下DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好 带手套。 • 冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免液氮 从液氮罐内溅出。 • 应注意控制冻存细胞的质量。 • 勿将冻存的细胞长时间放置在0～-60℃范围内。
复苏过程： ①将恒温水浴锅的温度调至37～40℃；
②从液氮中取出冻存小管，立即投入水浴锅中快速晃
• 实验室
• 无菌技术
• 显微技术
• 细胞冻存与复苏
• 细胞的分离、观察与分析
一、实验室 1. 基本组成：
• 准备室
• 无菌间 • 操作间 • 培养室 • 分析室
2.主要设备：
包括 水处理设备（纯水系统）、无菌设备（灭菌
锅、超净工作台等）、培养设备（培养箱）、分离
观察设备（离心机、显微镜）、保存设备（超低温
• 不同固定剂对细胞的不同成分、结构固定效果不
同。
• 选择合适的固定液是达到固定目的的基础。
常用固定剂： • 甲醇/醋酸：浓度为3:1，适用于观察染色体和 Giemsa染色。 • FAA固定液（40%福尔马林5ml+冰醋酸5ml+80%乙醇90ml）： 可用作固定植物的一般组织。 • 卡诺氏（乙醇60ml+氯仿30ml+冰醋酸10ml）：适用 于显示细胞化学成分。
动，使其在1～2min完全融解； ③将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻 轻吹匀； ④将细胞悬液经离心5min。弃上清液； ⑤给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀；
⑥将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。
五、细胞观察与分析
• 细胞计数：采用血细胞计数法，结果以每毫升细
胞数来表示。可采用结晶紫染色 • 细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比。常用 方法为台盼蓝染色法
• 常用光学显微镜、相差显微镜、倒置显微镜、荧
光显微镜等
四、细胞的冻存与复苏 • 细胞在传代过程中许多生物学性状容易发生改变， 如细胞的粘附性、染色体数目等； • 对有限增殖细胞系来说，传代次数是有限的； • 过多的传代增加污染机会； • 消耗大量人力物力。 细胞冻存与复苏
冻存： • 低温液氮冻存 ：－196℃
细胞染 Giemsa染色：将细胞核染成紫红色，细胞质染成粉
红色；
• 福尔根染色：细胞核粉红至紫红色，细胞质无色；
• 考马斯亮蓝染色：显示细胞骨架；
• 荧光染色
Giemsa染色
苏木精-伊红染色
福尔根染色
考马斯亮蓝染色
荧光显微镜下的大肠杆菌
• 总结
冰箱、液氮罐等）
二、无菌技术 • 在细胞培养过程中，操作环境、试验器皿、试剂
等要经过灭菌处理，确保无污染。 • 包括：培养用品的清洗、灭菌
• 培养用品的清洗：玻璃器皿、胶塞、塑料制品 • 灭菌： 细菌、真菌、支原体、病毒污染是细胞培养的最 大危险。
常用灭菌方法： • 物理灭菌
紫外线灭菌：空气、操作台等； 湿热灭菌：培养液、玻璃器皿、手术器械等； 过滤除菌：含血清的培养液。
间或培养基中，有的呈链状排列。抗真菌剂可预
防（两性霉素B）。
丝状菌污染
• 支原体污染：直径在0.2µm以下，难以通过过滤除 去。（可采用地衣红染色或荧光染色进行判断）
支原体污染
• 病毒：大小以纳米计，可以通过滤器。潜在病毒
是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作 中的难题。 • 交叉污染
三、显微技术
• 在细胞冻存过程中需要添加冷冻保护液。
• 常用低温保护剂：
甘油（10%）或 二甲基亚砜（7.5%—10%）
• 原则：慢冻
复苏： • 按照一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到 常温。 • 原则：快融（1-2分钟内即恢复到常温）
冻存过程： ①分装冻存小管； ②冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～8℃)，40min； ③置于普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min； ④ -30℃放置30min左右； ⑤在-70～-80℃下过夜； ⑥最后将冻存小管投入液氮保存。
注意： 1，压线的细胞记上不记下、 记左不记右 2，抱团的细胞记成一个 3，抱团的细胞超过10%需 重新打散后再记
细胞密度（个/ml）＝（4个大格细胞总数/4）×104（10的4次方） ×稀释倍数
细胞固定：把组织和细胞的原有结构尽可能完整地
保存下来。
• 使细胞的各部分易于着色，适于观察和长期保存。
• 化学灭菌：最常用70%乙醇；皮肤、台面等 • 抗生素灭菌：抑制细菌、真菌等污染。
污染检测与控制：
• 细菌：培养液颜色发黄，变混浊，显微镜下可见
大量圆球状颗粒漂浮。
• 真菌：常见有黑曲霉、酵母菌、烟曲霉等
培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在 生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可 见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之
注意事项： • 常温下DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好 带手套。 • 冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免液氮 从液氮罐内溅出。 • 应注意控制冻存细胞的质量。 • 勿将冻存的细胞长时间放置在0～-60℃范围内。
复苏过程： ①将恒温水浴锅的温度调至37～40℃；
②从液氮中取出冻存小管，立即投入水浴锅中快速晃