实验一、骨髓瘤细胞的培养

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1∶2稀释传代，每2～3天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

二材料：

1.试剂：

（1）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4℃保存。

不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100×L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。

不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml，NaHCO3 3.7g，100×L.G.溶液10ml，双抗溶液10ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。

完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后杂交瘤细胞培养。

（2）小牛血清灭活：从-20℃冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56℃30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶），-20℃冻存备用，尽量避免反复冻融。

（3）青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。

2.器材：

超净工作台、CO2恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等

三方法：

细胞冻存及复苏

先用24孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株，当长满时，再扩大到100ml 细胞瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10﹪DMSO，40﹪FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3×106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70℃冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40℃水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min，弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞，移入24孔板中培养。

四、细胞培养应注意事项

1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒，对于新购置或已经使用的玻璃器皿，一般先用先用0.1%新洁而灭浸泡24小时，再用自来水清洗，晾干，然后放置酸缸浸泡24小时，带

胶手套，捞起，用自来水将酸液冲洗干净（一般冲洗8-10次），用去离子水浸泡12小时，再用超纯水浸泡12小时，捞起烘干，细胞瓶用锡铂纸包扎瓶口，吸管塞上绵花，装入吸管桶内，165.5℃干热灭菌2-3小时，待冷却后，转入消毒柜里备用。

2. 培养基：大多数实验室采用的基础培养基是DMEM或RPMI-1640，按厂家规定的方法配制一般不会出问题。但是配制培养基的水的质量和血清添加成分是影响融合最重要的培养基素因各地水质差异很大，所以至少应用三蒸水或四蒸水，并定期检查制成的纯水质量。国内实验室大多采用新生犊牛血清配制培养基，不同来源和不同批次的血清支持杂交瘤生长的差异很大，应筛选出好的血清供作配制融合后选择性培养的HAT培养基。

准备重组药物的实验：

1、配制AMP+ LB固体培养基600ml，倒AMP+ LB平皿20个

2、AMP+ LB液体培养基400ml

3、空的试管20支

4、1.5ml EP管1盒

将以上灭菌。

附：LB培养基配方：

胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L

酵母提取物(Yeast extract) 5g/L

氯化钠(NaCl) 10g/L

另外根据经验值用5mol/LNaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4。

LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。

LB固体培养基倒板

①配制：100ml LB培养基加入1.5g琼脂粉

②抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

③倒板：一般20ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

④保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。

抗生素终浓度Amp 100ug/ml

骨髓间质干细胞分离培养的经验总结

骨髓间充质干细胞经验总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 1．直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC 的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC 的简便可行的方法，得到了广泛的应用。 culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24h,48h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。 2. 密度梯度离心法裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细

小鼠骨髓基质细胞使用说明

小鼠骨髓基质细胞小鼠骨髓基质细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。派瑞金提供的小鼠骨髓基质细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨髓基质细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。小鼠骨髓基质细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。小鼠骨髓基质细胞其他相关小鼠原代细胞：小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞

骨组织工程中骨髓基质细胞的研究进展.

作者单位:第四军医大学口腔医学院颌面外科,西安(710032 作者简介:刘彦普(1956-,河北人,副主任医师. 骨组织工程中骨髓基质细胞的研究进展 RESEARCH PR OGRESS ON BONE MARR OW MATRIC CE LL IN BONE TISSUE PR OJECT 刘彦普,钱奇春,杨维东中图分类号:R322.7文献标识码:A 文章编号:100524979(20020320229204 种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容。理想的骨种子细胞应具备以下特点:①取材容易,损伤小;②易定向分化为成骨细胞,传代繁殖力强;③适应性强,植入机体后能保持成骨活性。目前,作为骨组织工程的种子细胞有4种来源:骨、骨外膜、骨髓、骨外组织。这些来源各有优缺点,其中骨髓来源的骨髓基质细胞(b one m arrow strom al cell ,BMSC 具有来源广泛、取材方便、生长稳定、增殖快、定向分化力强、易于接种成活等优点,在骨组织工程中显示出良好的应用前景。1BMSC 的成骨潜能骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织,由基质细胞和细胞间基质构成。骨髓成骨能力主要来源于BMSC 中的成纤维细胞集落形成单位(colony forming unit fibroblast ,CFU 2F ,它具有多向分化潜能,在特定培养条件下可转化成多种间充质细胞,如成纤维系细胞、成骨系细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和内皮细胞等[1]。Mani 2atopoulos [2]等首次观察到鼠BMSC 在体外培养条件下具有形成钙化的骨样组织的能力,X 线衍射分析表明钙化物具有与骨组织类似的羟基磷灰石结构,免疫组织化学显示BMSC 产生I 型胶原,骨钙素(osteocalcin ,OC 与骨涎蛋白表达阴性。Benayahu [3]等将BMSC 体外

骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一)

骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。 1骨髓基质细胞的生物学特性 1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞3，4]。 1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化3]。 2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用5]。 3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理 3.1供体与受体 MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠7]。Zhao等8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。 3.2MSCs在脑内有迁移能力 Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞9]。 3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植

实验设计-骨髓基质细胞系的建立

小鼠骨髓细胞群细胞系的建立一、实验目的： 1) 通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系 2) 了解细胞培养的一般步骤和注意事项，培养无菌操作意识二、实验原理：细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用这个原理,将小鼠骨髓基质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代细胞得到传代细胞，经过若干代中，部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代的性质，分离得到细胞系。培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁，利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达到纯化的目的三、材料：实验小白鼠四、药剂及配制：

五、仪器器材：（1）培养皿×3、500ml烧杯×1、棉花、医用解剖器材（剪刀、镊子、解剖刀）、10ml注射器、4号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密pH试纸、0.22μm微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、油性笔、冻存管（2）超净工作台、CO2培养箱、高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、-86℃冰箱

2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌（1）超净工作台检查超净工作台是否正常；用之前用沾了75%酒精的脱脂棉擦拭，再开30min的紫外照射（2）小件物品用牛皮纸（报纸）将小件物品(如镊子、解剖刀等)包裹好放进饭盒里，放进灭菌锅，其他物品也一并放入蒸汽灭菌锅内，95KPa、121℃下灭菌30min （3）其他仪器灭菌 3、试剂配制（如上表） 4、器材准备 5、注意： 1) 使用高压灭菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险 2) 超净工作室和工作台必须清理干净，以免引起细胞污染浸泡 ?用5%的盐酸溶液浸泡过夜刷洗 ?用足量的洗衣粉反复刷洗,将瓶壁上的残渍洗干净浸酸 ?将干燥后的器皿用重络酸钾溶液(重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水 1L)浸泡过夜冲洗 ?将浸酸后的玻璃器皿用自来水冲洗,然后用蒸馏水,最后干燥、待用第二部分原代培养器材：解剖刀、剪刀、镊子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml离心管×4、培养瓶×2，冰块试剂：乙醚、D-Hank’s溶液、生理盐水仪器：超净工作台、离心机、显微镜步骤： 1.取样 1) 超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、镊子、注射器、平皿、冰块 2) 将小鼠用乙醚麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min。在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。 3) 剪去骺端。用10mL注射器抽取食量D-Hank’s液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。

地塞米松对骨髓基质细胞生物学特性的影响

地塞米松对骨髓基质细胞生物学特性的影响魏宽海　裴国献　郑　磊　王　前　金　丹　胡罢生【摘　要】目的　探讨地塞米松对体外培养的骨髓基质细胞增殖和分化等生物学特性的影响。方法　取4～6周龄新西兰兔双侧股骨骨髓3m l,体外分离,培养至第3代骨髓基质细胞,分别用地塞松浓度为0、10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mo l L的培养基,作用2、4及6天后,测定骨髓基质细胞的分裂增殖能力和碱性磷酸酶活性。结果　地塞米松对骨髓基质细胞的增殖起抑制作用,并随地塞米松浓度的升高而增强,其浓度大于10-8mo l L后抑制作用越显著。地塞米松在抑制增殖的同时,可显著增强骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性,浓度越高作用也越显著,但超过10-8mo l L后各浓度的作用效果无显著差别;这种作用随时间的延长而增强,至6天时与对照组相比可增强2～4倍。结论　地塞米松抑制骨髓基质细胞的增殖,但可促进其分化为成骨细胞,浓度为10-8mo l L较合适。【关键词】组织工程骨髓基质细胞地塞米松增殖分化 THE EFFECTS OF D EXA M ETHAS ONE ON B I OLOGI CAL CHARACTER ISTI CS OF B ONE M ARR OW STR OM AL CELL S W E I K uan2ha i,P E I Guo2x ian,ZH EN G L ei,et a l.D ep a rt m en t of O rthop ed ics and T raum a tology,N anf ang H osp ita l,the F irst M ilita ry M ed ica l U n iversity.Guang z hou Guang d ong,P.R.Ch ina 510515 【Abstract】 Objective　To investigate the effects of dexam ethasone on the p ro liferati on and differen tiati on of bone m arrow strom al cells(M SC).M ethods　M SC w ere iso lated and cu ltu red in v itro.A fter treatm en t w ith differen t concen trati on s of dexam ethasone(0,10210,1029,1028,1027and1026mo l L),the p ro liferati on and alkaline pho sphatase(AL P)activity of M SC w ere m easu red to evaluate the effect of dexam ethasone on the b i o logical characteristics of M SC.Results　D exam ethasone inh ib ited cell p ro liferati on.W ith the increase of concen trati on of dexam ethasone,the effect w as enhanced,w h ich w as mo re sign ifican t w hen the concen trati on of dexam ethasone w as over1028mo l L.A t the sam e ti m e,dexam ethasone p romo ted the activity of AL P.T h is effect w as enhanced w ith the increase of concen trati on of dexam ethasone,bu t the alterati on w as s m all w hen the concen trati on of dexam ethasone w as over1028mo l L.T he effects increased w ith the ti m e.T he activity of AL P w as enhanced2to4 ti m es w ith the dexam ethasone fo r6days.Conclusion　D exam ethasone inhab it the p ro liferati on of M SC,w h ile induce them to differen tiate in to o steob lasts.T he app rop riate concen trati on of dexam ethasone w as10-8mo l L. 【Key words】 T issue Engineering Bone m arrow strom al cells D exam ethasone P ro liferati on D ifferen tiati on Founda tion ite m s:N ati onal Basic Science R esearch and D evelopm en t Gran ts(973)(G1999054308);N ati onal N atu ral Science Foundati on of Ch ina(39970743) 用骨组织工程的方法修复骨缺损克服了以往方法的一些不足[1]。骨组织工程中种子细胞的选择与培养是最基本的环节,其来源有骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。综合相比之下,以骨髓为最优[2]。但骨髓基质细胞(bone m arrow strom al cells,M SC)具有多向分化潜能,为了提高其成骨效率,有必要选择合适的培养条件,以促进M SC分裂增殖并定向分化为成骨细胞。为此设计进行实验,观察地塞米松对M SC增殖与分化特性的影响,以期建立一种理想的M SC体外培养体系。 1　材料与方法 111　主要仪器与试剂基金项目:国家重点基础研究发展规划(973):组织工程的基本科学问题(G1999054308);国家自然科学基金资助项目(39970743)作者单位:第一军医大学南方医院创伤骨科(广州,510515) 倒置相差显微镜(O lym p u s),752紫外分光光度计(上海),B i o2rad450型酶联免疫检测仪(U SA),R PM I1640、96孔培养板(Gibco),胎牛血清(四季青生物制品公司),胰蛋白酶、T riton2100、M T T、二甲亚砜、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2250 (天象人生物制品公司),地塞米松、维生素C (Sigm a),碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。 112　方法 11211　M SC的培养　取4～6周健康新西兰大白兔,双侧股部剪毛,碘酒、酒精消毒后,用16号骨穿针自股骨大转子部穿入骨髓腔,注射器抽吸双侧股骨骨髓共3m l,混入无血清的1640培养基反复抽吸吹打。离心、过滤网,经4号针头反复抽吸,制成单细胞悬液。加入315m l含15%FB S的培养基,以 ? 2 3 2 ?Ch inese J R eparative and R econstructive Surgery,2001,V o l15(4)

骨髓基质干细胞及其应用的研究进展

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 骨髓基质干细胞及其应用的研究进展骨髓基质干细胞及其应用的研究进展( 作者：张秀云发表时间： 2019 年 11 月 ) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等， MSCs 移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs 移植治疗脑缺血的研究综述。 1 骨髓基质细胞的生物学特性 1.1 目前发现至少存在 3 种形态的 MSCs。 Colter 等从培养的人骨髓细胞中分离出 MSCs 后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平 MSCs 外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的 1 / 9

MSCs 能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将 MSCs 放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等。 MSCs 具有多向分化的潜能，MSCs 经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时， MSCs 即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞。 1.2 MSCs 的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化。 2 骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs 在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，Sanchoz Ramos 等发现，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derived neuotrofic factor， BDNF)可诱导人及小鼠的少数 MSCs 分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其 RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)。将人或小鼠的 MSCs 与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分 MSCs 分化为 NeuN 阳性的神经元样细胞及 GFAP 阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在 MSCs 的分化中发挥重要作用。 3 MSCS 移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理

人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选

生理学报 Acta Physiologica Sinica , August 25, 2006, 58 (4): 370-376 https://www.360docs.net/doc/cb17998194.html, 370 研究论文 Received 2006-03-30 Accepted 2006-06-02 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30400251). * Corresponding author. Tel: +86-10-62179164; Fax: +86-10-62173457; E-mail: jmchun@https://www.360docs.net/doc/cb17998194.html, 人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选刘美玲，石心泉，周万灏，刘洪文，李东，贾孟春* 国家人口计划生育委员会科学技术研究所，北京 100081 摘要：为了探讨人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)向成骨细胞分化过程中差异表达的基因，本实验采用体外培养人BMSCs ，诱导向成骨细胞分化。分别选取培养12和21 d 的细胞作为驱动方(driver)和实验方(tester)，进行抑制消减杂交，构建cDNA 消减文库，将挑选出的阳性克隆与GenBank 人基因库中已公布的核酸序列进行同源性比较分析。结果表明，从培养21 d 的BMSCs 中，筛查出5个差异基因，与人基因库中已知基因的同源性分别达到90%以上。有兴趣的是，核心蛋白聚糖和Bax inhibitor 1在培养21 d 的BMSCs 中差异表达。RT-PCR 检测显示，核心蛋白聚糖基因在培养21d 的细胞中高表达，而在12 d 的细胞中未检测到表达；Bax inhibitor 1基因在培养21 d 细胞中的表达明显高于12 d 的细胞。关键词：骨髓基质细胞；成骨细胞；核心蛋白聚糖；基因中图分类号：R 329 Screening differentially expressed genes in human bone marrow stromal cells at defined stage of differentiation LIU Mei-Ling, SHI Xin-Quan, ZHOU Wan-Hao, LIU Hong-Wen, LI Dong, JIA Meng-Chun * National Population Research Institute for Family Planning, Beijing 100081, China. Abstract: To screen differentially expressed genes involved in osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells (BMSCs)at defined stages, subtractive cDNA library was established by means of suppression subtractive hybridization. The BMSCs cultured for 12 and 21 d were used as driver and tester, respectively. A subtract library was successfully constructed and five positive clones were selected from the library. Sequencing analysis and homology comparison showed that the five clones differentially expressed in BMSCs cultured for 21 d were at least 90% homologous with the known genes in human GenBank. It was interestingly found that the osteogenic BMSCs cultured for 21 d differentially expressed decorin and Bax inhibitor 1. RT-PCR was performed to confirm the differentially expressed genes. The results showed that the expression of Bax inhibitor 1 was significantly higher in the cells of 21-day than that of 12-day, while the expression of decorin was only detected in the cells of 21-day.Key words: bone marrow stromal cells; osteoblast; decorin; gene 正常骨量的维持需要骨祖细胞不断提供足够的成骨细胞，而正常骨转换中所需要的成骨细胞来源于骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。BMSCs 是骨髓基质的一种间充质细胞，它能产生骨祖细胞系。BMSCs 具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可向脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞，甚至神经细胞等分化[1,2]。定向分化的骨祖细胞首先增殖并分化为前成骨细胞，同时表达I 型胶原和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)。I 型胶原的合成在细胞增殖期占主导地位，并与细胞的进一步分化有很大的关系。随后前成骨细胞分化为早期的成骨细胞并表达骨桥蛋白(osteopontin, OPN)，同时具有了骨基质形成的能力。最终，分化成熟的成骨细胞开始骨钙素(osteocalcin, OC)的表达，并进一步分化