基因表达分析

荧光定量PCR 在基因表达分析中的应用

所谓基因表达就是指在特定的时刻某种我们感兴趣的基因在组织或细胞中的mRNA 的表达数量。众所周知，很多的疾病（如肿瘤）的发生发展、很多药物的作用机理、很多生物的代谢调控作用等都和基因表达的变化有关，因此对基因表达进行精确定量是十分重要的。过去为了对mRNA 进行定量有了各种各样的方法，如Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交、传统PCR 等，但是我们也都知道这些技术灵敏性较差，重复性不好，操作比较烦琐，已经无法满足现在科研和检测的需要，于是荧光定量PCR 技术也就应运而生了。荧光定量PCR 技术能对核酸进行精确定量，因此大大提高了在基因表达的准确性和灵敏度，深受用户的青睐，广泛的应用于肿瘤研究、药物筛选、功能基因组研究等各个领域，目前已经成了很多科研文章发表的重要实验内容。

基因表达分析中常见到的重要问题

1、要检测的基因

基因表达分析的目的就是检测某种我们感兴趣的基因在不同组织或细胞中的表达差异。荧光定量PCR 技术可以对核酸物质的含量进行精确的定量，也就成了研究基因表达差异的一把利器。

在基因表达分析实验中要检测两个基因，一个是目的基因和另一个是看家基因。之所以要引入看家基因是由于不能确定要比较的样品所用的组织起始量相同。就是说比如有的老师提取正常样品的基因时用了100个细胞，而提取病变样品时只用了10个细胞，这时候的基因表达差异可能是由于提取时候的样品细胞数不同引起的，为了纠正这种误差，我们选用认为在两个样本中表达量不变的基因作为内参照，来去除这带来的干扰。例如，要研究某个基因在肿瘤样品和正常样品中的基因表达差异。我们在实验中发现我们选择研究的正常样品中的看家基因的表达量是肿瘤样品中的10倍，就认为正常样品的细胞数就是肿瘤样品细胞数的10倍，那么在肿瘤样品中目的基因的基因表达量应该乘以10倍，才能和正常样品进行比较。

2、计算基因表达差异

基因表达差异的计算是通过所得到的Ct 值来计算的，要计算两个样品（待测样品和对照样品）的目的基因的表达差异必须检测得到4个Ct 值：待测样品和对照样品中目的基因和看家基因的Ct 值。

那么基因表达差异应该计算为

基因表达差异=2（△Ct1-△Ct2）

目的基因 看家基因 待测样品 对照样品

△Ct1 △Ct2

这个公式的前提是看家基因和目的基因的扩增效率相同并且都为100%。

3、标准样品的准备

从理论上说基因表达分析实验是不需要标准品的，因为无需精确定出研究的组织或细胞中的某种基因的真实拷贝数，我们感兴趣的只是目标实验组和对照组的某种基因表达量的比值，也就是说我们关心的只是一个相对的数值和真实的拷贝数没有直接的关系。

那么在一些实验中为什么还要做标准曲线呢？这是为了纠正扩增效率不同的问题。从理论上来说PCR的扩增应该按照2的倍数向上递增，这样的扩增效率我们认为是100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是100%，尤其在不同的基因的扩增中间。因为基因表达分析实验用到了目的基因和看家基因两种基因，这样这两种基因的扩增效率会有所不同。那么如果用看家基因来校正目的基因就会带来误差，刚才的公式也就不再适用了。这样考虑到看家基因和目的基因不同的扩增效率，就需要做标准曲线来精确反应样品管中基因的相对含量。

基因表达分析标准品的准备相对比较简单，因为要知道的都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。

实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是我们根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如我们把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和你稀释的倍数是一样的，比如前面是10倍稀释，后面赋值也是10倍变化。

最后的实验结果可以得到样品的拷贝数，再通过拷贝数来分析不同样品中基因表达的倍数差异。

需不需要作标准曲线要根据实验的具体情况来定，假如通过实验的验证，发现目的基因和看家基因的扩增效率基本一致并都接近1，并且对实验的精度要求不高的情况下就可以不用做标准曲线，直接通过公式来计算基因的表达差异。但是如果研究的样本本身的基因表达差异就不大，如果进行忽略就可能造成较大误差，这样就需要做标准曲线来纠正这种误差了，作到较为精确的定量。

4、采用的定量方法

定量一般有两种方法，一种是探针法，另一种是染料法，即使用SYBR Green染料。由于探针合成的成本比较高，探针设计也有一定的难度，所以在基因表达分析中经常采用SYBR Green染料法进行荧光定量检测。这种SYBR GreenI染色法的优越性是使用方便，不需要针对不同的基因专门设计探针。想检测不同的基因只用在PCR体系中加入同一种荧光物质就可以。而且价格非常便宜。但它主要的缺点是灵敏度不够，因此在做实验前往往需要对实验条件进行摸索。

Stratagene荧光定量PCR仪基因表达分析解决方案

Stratagene荧光定量PCR仪和配套的Mxpro软件在处理基因表达分析方面的功能比较强大，下面进行简要的分析。

例如要分析IL1基因的表达情况，用看家基因GAPDH作为内参，采用的是SYBR GreenI

染料法。

1、板设置

1.1、有专门的基因表达分析实验模式，打开Mxpro程序操作窗口，首先弹出的对话框是要用户选择要进行的实验，做基因表达分析可以选择第二项Comparative Quantitation (Calibrator)。

1.2、方便的类型选择和孔设定。在板设置中选择样品的类型，可以将样品的名称写成GAPDH 和IL1，并将GAPDH设为看家基因（每个样品重复三次）。

看家基因和待测基因来自同一样本的用相同的字母来标记，如果是对照样品则标上Calibrator。

1.3、方便而快捷的反应条件设定。可以很容易设定扩增反应条件和熔解曲线条件。