扫描电镜样品制备技术

1）、取材的方法
动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材 基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离 表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的 游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品 块可稍大一些，一般观察面大小可在长X宽大约为 3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。 离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖 玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞 的盖片直接进行制样处理。 细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌 落涂到干净的盖片上，进行制样。 悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌， 然后再进行制样。
3、应能产生丰富的二次电子。可以导电的物质很多， 并非都能用作扫描电镜生物样品的导电处理。目前 常用于扫描生物样品制备导电处理的物质有黄金、 铂金及铂—钯合金和铂—铱合金。只有这些金属对 生物样品导电处理后，才能产生丰富的二次电。 4、样品能耐高真空和耐电子束的轰击。如果样品制 作的不合乎要求，当电子束在表面扫描时，会产生 电荷的积累，造成观察图像亮的地方很亮，黑的部 位很黑，样品的结构细节看不清楚，严重时会造成 样品的损伤。 生物医学样品为了满足扫描电镜的观察要求， 必须严格按照制作程序制作，含水的和不含水的样 品制作方法是不同。
组织表面的污物粘附牢固的样品，不能单纯用这种 方法进行清洗。 （3）、超声波清洗法。对那些表面污物较多、形态 结构复杂的样品，采取一般方法很难清洗干净时， 可用本法进行清洗。但是所选用的频率和功率一定 要合适，否则，会损伤样品。一般情况下功率用 20～25瓦；频率用5000～25000Hz,清洗0.5～15分钟 就可以。 （4）、水解蛋白酶清洗法。对组织表面粘附的蛋白 类物污，可用适当浓度的相应的水解蛋白酶水溶液 清洗。但使用的浓度和清洗的时间要严格掌握。 除上述几种方法外，有时还可以选用吐温－20 生理盐水溶液清洗。生物扫描样品的清洗很重要， 样品制作时必须认真对待。
2）、 取材的注意事项
（1）、所取材料块的大小要适中，在便于操作的情况 下，应尽量取得小一些。因为样品块过大制样时虽然 好操作，但各步骤处理的时间要加长；如果样品块取 得太小，不便于操作。 （2）、取材的部位一定要准确。在取材的过程中一定 要尽量去掉不需要的组织。 （3）、需要取对比样品时，实验组和对照组一定要取 相同一致的部位，这样才有对比意义。 （4）、对某些时间要求严格的样品，在取材时一定要 严格掌握取材的时间。 （5）、一些塑性大、脆性大的样品，为避免切割造成 的损伤，可采取冷冻断裂取材。
如可使样品不受液体表面张力作用，又能把液 体物质从样品中除去，使样品真正达到干燥，这就 要求样品制备专业技术人员选择一种好的干燥方法 才行。只有干燥方法得当，才能最大程度的保留下 生物组织细胞的生活状态时的原始形貌。 目前可用的干燥方法有多种，我们可以根据样 品的质地不同，选择不同的干燥方法。常用的干燥 方法有如下几种： （1）、空气干燥法（也叫自然干燥法）：将经过脱 水的样品或含水较少外壳坚硬（如虫卵、硬外壳的 昆虫等）的生物样品，直接放在防尘的地方让它自 然干燥，这就叫自然干燥法。这种方法一般不用。 因为液体会发挥产生表面张力，对样品在城损伤。
扫描电镜对生物医学观察样品的要求
扫描电镜是以电子束在样品表面扫描激发出的 二次电子作为成像第一信号，最后转换成样品形貌图 像的，所以它对观察的样品有特殊的要求，适合扫描 电镜观察的样品必须具备以下条件： 1、在形态结构上应接近生活状态。生物组织内含有 大量的水分，因此在观察之前，即要想办法去除水分， 又不能改变了它的原始形貌。 2、表面应具有很好的导电性能。生物样品是由低原 子序数的物质组成的，除在含水时能导电外，当干燥 后基本是一个绝缘体，这就要想办法进行导电处理， 使它能电镜生物样品的脱 水。也是采用上升浓度的方法，使用的脱水剂可以 用酒精和丙酮两种。
由于扫描电镜主要是观察研究生物组织或细胞 的表面形貌结构。因此，在脱水过程中，除了脱水 要干净、彻底；另一个必须注意的问题是，应严防 在换液时造成样品的自然干燥。
4、样品的干燥处理
在生物扫描样品制备中，这是一个很关键而重 要的步骤。如果干燥方法不当，会造成样品原始形 貌的损伤甚至完全破坏。 我们知道样品经过脱水后，虽然组织中的水分 被脱水剂取代掉了，但样品依然浸泡在液体脱水剂 中。大量试验证明，当液体物质自然挥发时，会产 生很大的表面张力，对生物组织细胞的表面微细结 构造成严重的损伤。
3）、样品的清洗
生物的组织器官，它们在体内由于执行不同的生 理功能，它们的表面都有不同的污物（如血液、分泌 物、粘液等）。为使这样的组织的真面目充分暴露出 来，以利于在扫描电镜下观察到真正的表面形貌，就 必须进行认真的清洗。根据组织表面的不同污物可采 取不同的清洗方法，清洗方法主要有如下几种： （1）、用缓冲液、蒸馏水漂洗或冲洗。这种方法主要 适用于组织表面附着的易溶于水的污物或附着不牢固 的污物的清洗（如一些动物体表面和植物组织表面的 污物）。 （2）、生理盐水清洗。本法主要适用于动物组织的清 洗，多数动物组织都可采用这一方法进行清洗，但那 些表面结构复杂（主要是凹凸不平）；
2、固定
固定所使用的固定液与透射电镜的相同。一般 也是采用戊二醛和锇酸双重固定法。在扫描电镜的 生物样品制备技术中，用锇酸固定结束，一定要用 双蒸水进行清洗，不能用缓冲液清洗，如果用缓冲 液清洗，干燥后的样品表面会出现结晶，影响扫描 图像的质量。 另外，由于一般情况下，扫描样品块都较大， 所以固定的时间要适当加长。
第一节
含水生物扫描样品制备的 基本步骤与方法
在生物扫描样品制备技术中，除了一些含水量 很少（如植物的花粉，干燥的木材），外壳很坚硬， 自然干燥不会造成形貌变化的材料（如骨骼、甲壳 虫等）外，所有含水生物材料都要按如下步骤制作 样品。
1、取材与清洗
扫描生物样品对取材的要求有很多方面同超薄 切片，但也有不同之处。