嗜铁细菌CAS17的分离鉴定及其对毒死蜱的降解特性研究_于婷
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
通用 CAS 检测平板制作： 先配制好 1 mmol·L － 1 CaCl2 溶液、1 mmol·L － 1 MgSO·4 7H2 O 溶液、10% 酸 水解酪蛋白溶液（ 121 ℃ 、15 min 单独灭菌） ； 再分别 取 0． 2 mL CaCl2 溶液、0． 2 mL MgSO·4 7H2 O 溶液、6 mL 10% 的 酸 水 解 酪 蛋 白 溶 液，加 入 生 物 缓 冲 液 Pipes（ sigma） ，调 pH 6． 8 ～ 7． 0． 去离子水定容到 100 mL． 加入 2 g 琼脂粉，121 ℃ 、15 min 灭菌． 当以上的 固体培养基灭完菌后，温度降低到 60 ℃ 时，以 5 mL CAS 蓝色检测液 / 每 100 mL CAS 培养基的量沿着 三角瓶壁加入，混合均匀． 注意不要产生气泡，影响 平板检测实验． 然后按照每皿 30 mL 倾注于培养皿 （ 直径 90 mm） 中． 2． 2 嗜铁菌菌株的分离及驯化 2． 2． 1 嗜铁菌菌株的分离 采集苹果、梨、核桃等 果树的根际土壤，带回实验室，自然风干后过筛（ 孔 径为 0． 85 mm） 备用． 取 1 g 土样，加入 50 mL 灭菌 蒸馏水，于室温 150 r·min － 1 条件下振荡培养 2 h，静 置取上清液，通过 CAS 检测平板法（ Machuca et al． ， 2003） 进行筛选． 根据橘黄色晕圈的有无及大小筛 选出产嗜铁素能力较强的菌株． 2． 2． 2 毒死蜱降解菌的驯化 将已获得的具有较 强嗜铁能力的嗜铁菌细菌菌株接种于含有毒死蜱 （ 浓度 为 50 mg·L － 1 ） 的 LB 培 养 液 中，30 ℃ 、150 r·min － 1 振 荡 培 养 48 h 后，取 1 mL 接 入 到 含 100 mg·L － 1 毒死蜱的 LB 培养液中，以同样的方法培养，
1 引言（ Introduction）
毒死蜱（ Chlorpyrifos） 是一种高效、广谱、中等毒 性的有机磷酸酯类杀虫杀螨剂，是目前全世界生产 和销售量最大的杀虫剂品种之一，也是世界卫生组 织唯一许可的有机磷品种，有着非常广阔的市场和
应用前景． 但其残留对环境和人畜都会带来一定的 负面影响： 对动物眼睛有轻度刺激，对人类皮肤有 明显刺激，对 水 生 生 物 及 蜜 蜂 具 有 较 高 的 毒 性，对 烟草、番茄等较敏感（ Tyler et al． ，2008） ，可能对人 的神经系统和脑部发育有潜在影响，对儿童健康有 害（ 王金花等，2006） ． 国内外研究表明，生物降解是
第 34 卷第 1 期 2014 年 1 月
环境科学学报 Acta Scientiae Circumstantiae
Vol． 34，No． 1 Jan． ，2014
于婷，董庆龙，刘嘉芬，等． 2014． 嗜铁细菌 CAS17 的分离鉴定及其对毒死蜱的降解特性研究［J］． 环境科学学报，34（ 1） ： 136-142 Yu T，Dong Q L，Liu J F，et al． 2014． Isolation，identification and chlorpyrifos-degradation characteristics of siderophore producing bacterial strain CAS17 ［J］． Acta Scientiae Circumstantiae，34（ 1） ： 136-142
录用日期： 2013-04-09
摘要： 采用改良定向培育法，从获得的几株嗜铁细菌菌株中经过驯化筛选，获得 1 株对毒死蜱有较高降解作用的细菌 CAS17． 结合其生理生化 特性及 16S rＲNA 序列分析，将其鉴定为耐盐短杆菌（ Brevibacterium halotolerans） ． 生长特性和毒死蜱降解试验结果表明，该菌株对毒死蜱有较 高的耐受性，在毒死蜱浓度达到 800 mg·L － 1 时仍可生长． 最适毒死蜱降解浓度为≤100 mg·L － 1 ，降解率可达 67% 左右，浓度继续升高时降解效 果明显降低； 最适降解温度为 30 ℃ ，对高温敏感； 对 pH 值有着较强的适应范围，pH 值在 5 ～ 9 之间的降解率波动不大； 最适降解时间为 48 h， 振荡速率为 150 r·min － 1 ，接种量为 4% ； 适合其降解的最佳外加碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉，最佳无机盐为 CaCl2 ． 关键词： 毒死蜱； 生物降解； 鉴定； 降解特性
基金项目： 国家自然科学基金（ No． 31100086） Supported by the National Natural Science Foundation of China（ No． 31100086） 作者简介： 于婷（ 1982—） ，女，E-mail： yuting812812@ 163． com； * 通讯作者（ 责任作者） ，E-mail： yuxianmei95@ 163． com Biography： YU Ting（ 1982—） ，female，E-mail： yuting812812@ 163． com； * Corresponding author，E-mail： yuxianmei95@ 163． com
YU Ting1，2 ，DONG Qinglong1 ，LIU Jiafen1 ，AN Miao1 ，WANG Hairong1 ，YU Xianmei1，*
1． Shandong Institute of Pomology，Tai'an 271000
2． Shangdong Agricultural University，Tai'an 271018
因此，本 研 究 拟 采 用 改 良 定 向 培 育 法，即 在 培 养基中添加农药，对分离自土壤的嗜铁菌菌株进行 驯化，筛选 毒 死 蜱 降 解 菌 株，并 研 究 农 药 本 身、温 度、振荡速率、pH 值、接种量和碳氮源等环境因子对 菌株降解毒死蜱活性的影响． 以期为植物根际促生 菌在毒死蜱污染环境生物修复中的开发利用，提供 实验数据和科学依据．
Cloning Kit 等分子生物学试剂购自北京全式金生物 技术有限公司； 石油醚等生化试剂均为国产分析纯． 2． 1． 3 培养基 LB 培养液： 胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化钠 10 g，1000 mL 去离子水，pH 值 7． 0，高 压蒸汽灭菌（ 121 ℃ 、30 min） ，每个 150 mL 的三角 瓶均装 50 mL．
嗜铁细菌 CAS17 的 分 离 鉴 定 及 其 对 毒 死 蜱 的 降 解 特
性研究
于婷1，2 ，董庆龙1 ，刘嘉芬1 ，安淼1 ，王海荣1 ，余贤美1，*
1． 山东省果树研究所，泰安 271000
2． 山东农业大学，泰安 271018
收稿日期： 2012-03-04
修回日期： 2013-04-09
嗜铁菌作为一类重要的植物根际促生菌，在促 进植物生长和防治植物病害方面都发挥了很大的 作用． 研究证实，嗜铁菌产生的嗜铁素可与植物根 际病原微生物争夺有限的铁营养，从而抑制病原微 生物生长繁殖，起到生物防治作用； 同时，植物可以 利用微生物产生的嗜铁素螯合的铁，从而改善植物 的铁营养，防 治 土 壤 植 物 缺 铁 失 绿 症 的 发 生，促 进 植物生长（ Miethke et al． ，2007； 余贤美，2009 ） ． 如 果嗜铁菌同时具有降解某种农药的性能，将对环境 污染的生物修复有重大意义． 然而，目前尚未有将 植物根际促生菌与农药污染土壤生物修复结合起 来研究的相关报道．
文章编号： 0253-2468（ 2014） 01-136-07
中图分类号： X172
文献标识码： A
Isolation， identification and chlorpyrifos-degradation characteristics of siderophore producing bacterial strain CAS17
2 材料与方法（ Materials and methods）
2． 1 主要仪器、试剂和培养基 2． 1． 1 主 要 仪 器 UV-2201 紫 外 分 光 光 度 计 （ Shimadzu，Japan ） ，Biometra PCＲ 仪 （ Biometra， Germany） ，DYY-10 三恒电泳仪，Biorad GelDoc XＲ 凝胶成像系统（ BioＲad，America） ． 2． 1． 2 试剂 95% 毒死蜱原药购自山东天成农药 有 限 公 司； EasyTaqTM DNA Polymerase、dNTPs、 EasyPureTM Quick Gel Extraction Kit、pEASY-T1
Ｒeceived 4 March 2013；
received in revised form 9 April 2013；
accepted 9 April 2013
Hale Waihona Puke Baidu
Abstract： The siderophore producing strain CAS17，capable of utilizing and degrading chlorpyrifos，was obtained and preliminarily identified as Brevibacterium halotolerans according to its physiological － biochemical characteristics and 16S rＲNA sequence analysis． The growth and degradation characteristics of the strain were tested． The result showed that the strain could grow well when chlorpyrifos concentration was 800 mg·L － 1 ，indicating high tolerance to the high concentration of chlorpyrifos． For growth and chlorpyrifos degradation，the optimal conditions were concentration of no more than 100 mg·L － 1 with about 67% of the degradation rate，temperature of 30 ℃ pH value from 5 to 9，the fermentation parameters at 150 r·min － 1 for 48 h and inoculation quantity of 4% ． The optimal additional carbon，nitrogen source and inorganic salt for chlorpyrifos degradation were glucose，yeast and CaCl2 ， respectively． Keywords： siderophore； biodegradation； identification； degrading characteristics
1期
于婷等： 嗜铁细菌 CAS17 的分离鉴定及其对毒死蜱的降解特性研究
137
控制和去除毒死蜱残留的有效途径之一，目前国内 已报道的毒死蜱降解菌有人苍白杆菌（ Ochrobactrum anthropi） 、假单胞茵属（ Pseudomonas sp． ） 、伯克霍尔 德 氏 菌 属 （ Burkholderia sp． ） 、鞘 氨 醇 单 胞 菌 （ Sphingomonas sp． ） 、玫 瑰 红 红 球 菌 （ Ｒhodocouus rhodochrous） 、蜡状芽孢杆菌 （ Bacillus cereus） 、哈 夫 尼菌（ Hafnia sp． ） 、镰孢霉菌 （ Fusarium sp． ） 、侧芽 孢 杆 菌 （ Bacillus latersprorus ） 和 粪 产 碱 杆 菌 （ Alcaligenes faecalis ） （ 史 延 华，2011； 李 晓 慧 等， 2007； 吴 祥 为 等 2006； 段 海 明 等，2011； 张 利 等， 2008； 王金花等，2005； 王晓等，2006； 杨丽等，2005） 等． 随着毒死蜱的广泛生产和使用，毒死蜱的污染 也势必会越来越严重，因此，有必要筛选出更多、更 加高效的降解菌株（ 黄强等，2008） ．
LB 平板： 胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化钠 10 g，琼脂粉 17 g，1000 mL 去离子水，pH 值 7． 0，高压 蒸汽灭菌（ 121 ℃ 、30 min） ． 2． 1． 4 CAS 检测平板 CAS 蓝色检测液的制作： 将 0． 07 g 的 CAS（ Chrome azurol S） 溶于 50 mL 去离 子水中，再加入 10 mL （ 1 mmol·L － 1 ） 的 FeCl3 溶液 （ 含有 10 mmol·L － 1 的 HCl） ，记为溶液 a； 将 0． 06 g 的 HDTMA（ Hexadecyltrimethylammonium bromide） 溶 于 40 mL 去离子水中，记为溶液 b； 将 a 溶液沿着烧 杯壁缓缓加入到 b 溶液中，轻轻晃动，使得溶液 a 与 溶液 b 混合均匀，得到溶液 c，即 CAS 蓝色检测液． 121 ℃ 、15 min 灭菌．
1 引言（ Introduction）
毒死蜱（ Chlorpyrifos） 是一种高效、广谱、中等毒 性的有机磷酸酯类杀虫杀螨剂，是目前全世界生产 和销售量最大的杀虫剂品种之一，也是世界卫生组 织唯一许可的有机磷品种，有着非常广阔的市场和
应用前景． 但其残留对环境和人畜都会带来一定的 负面影响： 对动物眼睛有轻度刺激，对人类皮肤有 明显刺激，对 水 生 生 物 及 蜜 蜂 具 有 较 高 的 毒 性，对 烟草、番茄等较敏感（ Tyler et al． ，2008） ，可能对人 的神经系统和脑部发育有潜在影响，对儿童健康有 害（ 王金花等，2006） ． 国内外研究表明，生物降解是
第 34 卷第 1 期 2014 年 1 月
环境科学学报 Acta Scientiae Circumstantiae
Vol． 34，No． 1 Jan． ，2014
于婷，董庆龙，刘嘉芬，等． 2014． 嗜铁细菌 CAS17 的分离鉴定及其对毒死蜱的降解特性研究［J］． 环境科学学报，34（ 1） ： 136-142 Yu T，Dong Q L，Liu J F，et al． 2014． Isolation，identification and chlorpyrifos-degradation characteristics of siderophore producing bacterial strain CAS17 ［J］． Acta Scientiae Circumstantiae，34（ 1） ： 136-142
录用日期： 2013-04-09
摘要： 采用改良定向培育法，从获得的几株嗜铁细菌菌株中经过驯化筛选，获得 1 株对毒死蜱有较高降解作用的细菌 CAS17． 结合其生理生化 特性及 16S rＲNA 序列分析，将其鉴定为耐盐短杆菌（ Brevibacterium halotolerans） ． 生长特性和毒死蜱降解试验结果表明，该菌株对毒死蜱有较 高的耐受性，在毒死蜱浓度达到 800 mg·L － 1 时仍可生长． 最适毒死蜱降解浓度为≤100 mg·L － 1 ，降解率可达 67% 左右，浓度继续升高时降解效 果明显降低； 最适降解温度为 30 ℃ ，对高温敏感； 对 pH 值有着较强的适应范围，pH 值在 5 ～ 9 之间的降解率波动不大； 最适降解时间为 48 h， 振荡速率为 150 r·min － 1 ，接种量为 4% ； 适合其降解的最佳外加碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉，最佳无机盐为 CaCl2 ． 关键词： 毒死蜱； 生物降解； 鉴定； 降解特性
基金项目： 国家自然科学基金（ No． 31100086） Supported by the National Natural Science Foundation of China（ No． 31100086） 作者简介： 于婷（ 1982—） ，女，E-mail： yuting812812@ 163． com； * 通讯作者（ 责任作者） ，E-mail： yuxianmei95@ 163． com Biography： YU Ting（ 1982—） ，female，E-mail： yuting812812@ 163． com； * Corresponding author，E-mail： yuxianmei95@ 163． com
YU Ting1，2 ，DONG Qinglong1 ，LIU Jiafen1 ，AN Miao1 ，WANG Hairong1 ，YU Xianmei1，*
1． Shandong Institute of Pomology，Tai'an 271000
2． Shangdong Agricultural University，Tai'an 271018
因此，本 研 究 拟 采 用 改 良 定 向 培 育 法，即 在 培 养基中添加农药，对分离自土壤的嗜铁菌菌株进行 驯化，筛选 毒 死 蜱 降 解 菌 株，并 研 究 农 药 本 身、温 度、振荡速率、pH 值、接种量和碳氮源等环境因子对 菌株降解毒死蜱活性的影响． 以期为植物根际促生 菌在毒死蜱污染环境生物修复中的开发利用，提供 实验数据和科学依据．
Cloning Kit 等分子生物学试剂购自北京全式金生物 技术有限公司； 石油醚等生化试剂均为国产分析纯． 2． 1． 3 培养基 LB 培养液： 胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化钠 10 g，1000 mL 去离子水，pH 值 7． 0，高 压蒸汽灭菌（ 121 ℃ 、30 min） ，每个 150 mL 的三角 瓶均装 50 mL．
嗜铁细菌 CAS17 的 分 离 鉴 定 及 其 对 毒 死 蜱 的 降 解 特
性研究
于婷1，2 ，董庆龙1 ，刘嘉芬1 ，安淼1 ，王海荣1 ，余贤美1，*
1． 山东省果树研究所，泰安 271000
2． 山东农业大学，泰安 271018
收稿日期： 2012-03-04
修回日期： 2013-04-09
嗜铁菌作为一类重要的植物根际促生菌，在促 进植物生长和防治植物病害方面都发挥了很大的 作用． 研究证实，嗜铁菌产生的嗜铁素可与植物根 际病原微生物争夺有限的铁营养，从而抑制病原微 生物生长繁殖，起到生物防治作用； 同时，植物可以 利用微生物产生的嗜铁素螯合的铁，从而改善植物 的铁营养，防 治 土 壤 植 物 缺 铁 失 绿 症 的 发 生，促 进 植物生长（ Miethke et al． ，2007； 余贤美，2009 ） ． 如 果嗜铁菌同时具有降解某种农药的性能，将对环境 污染的生物修复有重大意义． 然而，目前尚未有将 植物根际促生菌与农药污染土壤生物修复结合起 来研究的相关报道．
文章编号： 0253-2468（ 2014） 01-136-07
中图分类号： X172
文献标识码： A
Isolation， identification and chlorpyrifos-degradation characteristics of siderophore producing bacterial strain CAS17
2 材料与方法（ Materials and methods）
2． 1 主要仪器、试剂和培养基 2． 1． 1 主 要 仪 器 UV-2201 紫 外 分 光 光 度 计 （ Shimadzu，Japan ） ，Biometra PCＲ 仪 （ Biometra， Germany） ，DYY-10 三恒电泳仪，Biorad GelDoc XＲ 凝胶成像系统（ BioＲad，America） ． 2． 1． 2 试剂 95% 毒死蜱原药购自山东天成农药 有 限 公 司； EasyTaqTM DNA Polymerase、dNTPs、 EasyPureTM Quick Gel Extraction Kit、pEASY-T1
Ｒeceived 4 March 2013；
received in revised form 9 April 2013；
accepted 9 April 2013
Hale Waihona Puke Baidu
Abstract： The siderophore producing strain CAS17，capable of utilizing and degrading chlorpyrifos，was obtained and preliminarily identified as Brevibacterium halotolerans according to its physiological － biochemical characteristics and 16S rＲNA sequence analysis． The growth and degradation characteristics of the strain were tested． The result showed that the strain could grow well when chlorpyrifos concentration was 800 mg·L － 1 ，indicating high tolerance to the high concentration of chlorpyrifos． For growth and chlorpyrifos degradation，the optimal conditions were concentration of no more than 100 mg·L － 1 with about 67% of the degradation rate，temperature of 30 ℃ pH value from 5 to 9，the fermentation parameters at 150 r·min － 1 for 48 h and inoculation quantity of 4% ． The optimal additional carbon，nitrogen source and inorganic salt for chlorpyrifos degradation were glucose，yeast and CaCl2 ， respectively． Keywords： siderophore； biodegradation； identification； degrading characteristics
1期
于婷等： 嗜铁细菌 CAS17 的分离鉴定及其对毒死蜱的降解特性研究
137
控制和去除毒死蜱残留的有效途径之一，目前国内 已报道的毒死蜱降解菌有人苍白杆菌（ Ochrobactrum anthropi） 、假单胞茵属（ Pseudomonas sp． ） 、伯克霍尔 德 氏 菌 属 （ Burkholderia sp． ） 、鞘 氨 醇 单 胞 菌 （ Sphingomonas sp． ） 、玫 瑰 红 红 球 菌 （ Ｒhodocouus rhodochrous） 、蜡状芽孢杆菌 （ Bacillus cereus） 、哈 夫 尼菌（ Hafnia sp． ） 、镰孢霉菌 （ Fusarium sp． ） 、侧芽 孢 杆 菌 （ Bacillus latersprorus ） 和 粪 产 碱 杆 菌 （ Alcaligenes faecalis ） （ 史 延 华，2011； 李 晓 慧 等， 2007； 吴 祥 为 等 2006； 段 海 明 等，2011； 张 利 等， 2008； 王金花等，2005； 王晓等，2006； 杨丽等，2005） 等． 随着毒死蜱的广泛生产和使用，毒死蜱的污染 也势必会越来越严重，因此，有必要筛选出更多、更 加高效的降解菌株（ 黄强等，2008） ．
LB 平板： 胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化钠 10 g，琼脂粉 17 g，1000 mL 去离子水，pH 值 7． 0，高压 蒸汽灭菌（ 121 ℃ 、30 min） ． 2． 1． 4 CAS 检测平板 CAS 蓝色检测液的制作： 将 0． 07 g 的 CAS（ Chrome azurol S） 溶于 50 mL 去离 子水中，再加入 10 mL （ 1 mmol·L － 1 ） 的 FeCl3 溶液 （ 含有 10 mmol·L － 1 的 HCl） ，记为溶液 a； 将 0． 06 g 的 HDTMA（ Hexadecyltrimethylammonium bromide） 溶 于 40 mL 去离子水中，记为溶液 b； 将 a 溶液沿着烧 杯壁缓缓加入到 b 溶液中，轻轻晃动，使得溶液 a 与 溶液 b 混合均匀，得到溶液 c，即 CAS 蓝色检测液． 121 ℃ 、15 min 灭菌．