细胞培养技术及其应用
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含义 ：两方面 结果： 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成
组织， 有机体的绝大多数细胞属于该种类型
因此,此类细胞在体外培养时粘附于一固相表面 才能生存和生长。
细胞分类
培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某 一固相表面才能生存和生长，因而 属于粘附型细胞。
粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能 生存的细胞
细胞培养技术
原代培养：实质就是初次培养，亦即培养物一经接
种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培 养物的生长器皿。
原代培养的方法：
1. 植块培养法：如：眼眶肌肉组织、结缔组织、脂肪组 织、血管平滑肌、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕等
2. 分散细胞培养法：机械解离法、 酶学解离法、螯合刘 解离法等
如：脉络微血管内皮细胞、胆管癌组织、脉络膜黑色素 瘤组织、淋巴母细胞瘤等。
需进行传代，主要目的是补充细胞生长生存所需要 的营养、清除代谢产物，以维持其生长生存的需要
细胞培养技术
细胞的纯化：
1. 机械刮除法 2. 酶消化法 3. 免疫磁珠分离法 4. 流式细胞术
用CD34抗原特异分离其阳性细胞 (脉络微血管内皮细胞)
5. 克隆法
细胞培养技术
转染后筛选稳定表达细胞
细胞冻存和复苏
体外培养
细胞培养技术 细胞分类 培养细胞的优缺点
体外培养技术的应用
基因转染技术
表达质粒载体和腺病毒载体 siRNA干扰
体外培养细胞在药理学领域的应用 干细胞研究与发展前景
体外培养
细胞培养的基本概念
体外培养：就是将活体结构成分 (诸如活组
织、活体细胞或者活体器官等)甚或活的个体 从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内 生存环境的体外环境中，让其生长和发育的 方法。
体外培养的器具
培养器具：液氮罐、酸缸、过滤装置、
手术器械、注射器、移液器、筛网、细 胞刮刀、克隆缸及其它杂品
耗材：培养瓶，巴氏德吸管、刻度吸管
电动吸引器、培养板、 冻存管、离心管、 细胞计数池等
清洗和消毒
清洗：浸泡、刷洗、浸酸、冲洗 灭菌：
1) 物理方法：过滤除菌、高压蒸气灭菌、高 温干热灭菌、紫外线消毒、电离辐射灭菌等； 2) 化学方法：甲醛、环氧乙烷、乙醇、洗泌 泰、碘伏等。
冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞 器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形 成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致 产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞 膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是 防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
兔平滑肌细胞
瘢痕疙瘩组织来源的成纤维细胞(4×10)
细胞冻存和复苏
冻存：细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工
作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人 力国、经费，减少污染，减少细胞生物学特性 变化。
细胞冻存和复苏
慢冻程序
标准程序：
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器
如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮
形态： 似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
细胞分类
成纤维细胞样细胞 生长特点
排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起
细胞培养技术
原代培养的注意事项：
1.培养液：选择合适的培养液、添加必须的添加 物、pH值、及时换液
2.培养空间：气体环境(O2、CO2) 3.选择适当的培养方法。
细胞培养技术
继代培养：对原代培养物的传代(植块培养物和器
官培养物、分散细胞培养物、悬浮培养物)
传代：体外培养的所有细胞，生长到一定程度都
细胞分类
细胞分类
按生长方式:
粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞。
绝大多数有机体细胞属粘附型细胞， 只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞 可在悬浮状态下生长
细胞分类
贴附(粘附)型细胞
粘附: 是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式
体外培养的基本原理
体外培养技术：就是模拟体内的生理环境，
在无菌适当的温度、湿度和一定营养条件下， 使活体的结构成分在体外环境中生存和生长，并 维持其结构和功能。
体外培养的设备
主要仪器设备：超净工作台、 CO2培
养箱、倒置显微镜、离心机、自动双重 纯水蒸馏器、纯水仪、冰箱、压力蒸汽 消毒器、电热干燥箱、天平、酶标仪、 微孔板震荡器
细胞分类
类型
细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位
外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面
外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
细胞分类
分类 根据形态大致的不同，主要2类： 上皮样 成纤维细胞样 其它，不定型
细胞分类
上皮样细胞型 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞
体外培养的条件
营养条件：水、无机盐类、葡萄糖、维生
素、氨基酸等
其它条件：温度、湿度、氧和酸碱度、渗
透压、生长因子等
体外培养的大环境
培养液和培养用液
培养液：
1.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解 乳蛋白
2.合成培养基：RPMI1640、L-DMEM、 M199 、H-DMEM、Ham F12等
3.混合培养液
如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞
扁平，不规则多角形，中有圆形核
细胞分类
上皮样细胞型
生长特点
易相连成片 相靠—紧密相连—成薄层—铺石状
生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动
肺癌细胞(10×10)
细胞分类
成纤维细胞样细胞 名称： 凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源： 由中胚层间充质组织起源的组织
培养液和培养用液
培养用液：
1. 平衡盐溶液：D-Hank’s BSS、Hank’s BSS、PBS等 2. 消化液：胰蛋白酶溶液、EDTA-Na溶液、胰 蛋白酶及EDTA的混合溶液、胶原酶溶液等 3. 水体酶抑制剂： 4. pH调整液：NaNO3溶液、HEPES溶液 5. 其它：抗生素液、谷氨酰胺溶液。
组织， 有机体的绝大多数细胞属于该种类型
因此,此类细胞在体外培养时粘附于一固相表面 才能生存和生长。
细胞分类
培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某 一固相表面才能生存和生长，因而 属于粘附型细胞。
粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能 生存的细胞
细胞培养技术
原代培养：实质就是初次培养，亦即培养物一经接
种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培 养物的生长器皿。
原代培养的方法：
1. 植块培养法：如：眼眶肌肉组织、结缔组织、脂肪组 织、血管平滑肌、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕等
2. 分散细胞培养法：机械解离法、 酶学解离法、螯合刘 解离法等
如：脉络微血管内皮细胞、胆管癌组织、脉络膜黑色素 瘤组织、淋巴母细胞瘤等。
需进行传代，主要目的是补充细胞生长生存所需要 的营养、清除代谢产物，以维持其生长生存的需要
细胞培养技术
细胞的纯化：
1. 机械刮除法 2. 酶消化法 3. 免疫磁珠分离法 4. 流式细胞术
用CD34抗原特异分离其阳性细胞 (脉络微血管内皮细胞)
5. 克隆法
细胞培养技术
转染后筛选稳定表达细胞
细胞冻存和复苏
体外培养
细胞培养技术 细胞分类 培养细胞的优缺点
体外培养技术的应用
基因转染技术
表达质粒载体和腺病毒载体 siRNA干扰
体外培养细胞在药理学领域的应用 干细胞研究与发展前景
体外培养
细胞培养的基本概念
体外培养：就是将活体结构成分 (诸如活组
织、活体细胞或者活体器官等)甚或活的个体 从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内 生存环境的体外环境中，让其生长和发育的 方法。
体外培养的器具
培养器具：液氮罐、酸缸、过滤装置、
手术器械、注射器、移液器、筛网、细 胞刮刀、克隆缸及其它杂品
耗材：培养瓶，巴氏德吸管、刻度吸管
电动吸引器、培养板、 冻存管、离心管、 细胞计数池等
清洗和消毒
清洗：浸泡、刷洗、浸酸、冲洗 灭菌：
1) 物理方法：过滤除菌、高压蒸气灭菌、高 温干热灭菌、紫外线消毒、电离辐射灭菌等； 2) 化学方法：甲醛、环氧乙烷、乙醇、洗泌 泰、碘伏等。
冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞 器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形 成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致 产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞 膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是 防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
兔平滑肌细胞
瘢痕疙瘩组织来源的成纤维细胞(4×10)
细胞冻存和复苏
冻存：细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工
作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人 力国、经费，减少污染，减少细胞生物学特性 变化。
细胞冻存和复苏
慢冻程序
标准程序：
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器
如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮
形态： 似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
细胞分类
成纤维细胞样细胞 生长特点
排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起
细胞培养技术
原代培养的注意事项：
1.培养液：选择合适的培养液、添加必须的添加 物、pH值、及时换液
2.培养空间：气体环境(O2、CO2) 3.选择适当的培养方法。
细胞培养技术
继代培养：对原代培养物的传代(植块培养物和器
官培养物、分散细胞培养物、悬浮培养物)
传代：体外培养的所有细胞，生长到一定程度都
细胞分类
细胞分类
按生长方式:
粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞。
绝大多数有机体细胞属粘附型细胞， 只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞 可在悬浮状态下生长
细胞分类
贴附(粘附)型细胞
粘附: 是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式
体外培养的基本原理
体外培养技术：就是模拟体内的生理环境，
在无菌适当的温度、湿度和一定营养条件下， 使活体的结构成分在体外环境中生存和生长，并 维持其结构和功能。
体外培养的设备
主要仪器设备：超净工作台、 CO2培
养箱、倒置显微镜、离心机、自动双重 纯水蒸馏器、纯水仪、冰箱、压力蒸汽 消毒器、电热干燥箱、天平、酶标仪、 微孔板震荡器
细胞分类
类型
细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位
外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面
外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
细胞分类
分类 根据形态大致的不同，主要2类： 上皮样 成纤维细胞样 其它，不定型
细胞分类
上皮样细胞型 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞
体外培养的条件
营养条件：水、无机盐类、葡萄糖、维生
素、氨基酸等
其它条件：温度、湿度、氧和酸碱度、渗
透压、生长因子等
体外培养的大环境
培养液和培养用液
培养液：
1.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解 乳蛋白
2.合成培养基：RPMI1640、L-DMEM、 M199 、H-DMEM、Ham F12等
3.混合培养液
如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞
扁平，不规则多角形，中有圆形核
细胞分类
上皮样细胞型
生长特点
易相连成片 相靠—紧密相连—成薄层—铺石状
生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动
肺癌细胞(10×10)
细胞分类
成纤维细胞样细胞 名称： 凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源： 由中胚层间充质组织起源的组织
培养液和培养用液
培养用液：
1. 平衡盐溶液：D-Hank’s BSS、Hank’s BSS、PBS等 2. 消化液：胰蛋白酶溶液、EDTA-Na溶液、胰 蛋白酶及EDTA的混合溶液、胶原酶溶液等 3. 水体酶抑制剂： 4. pH调整液：NaNO3溶液、HEPES溶液 5. 其它：抗生素液、谷氨酰胺溶液。